5 Gga-miR-144-3p对鸡柔嫩艾美耳球虫感染的炎症反应作用研究

【作者】 董理月； 唐美慧； 于海亮； 汤建强； 戴国俊；

【机构】 扬州大学动物科学与技术学院；

【摘要】 基于课题组前期RNA-seq结果,本研究对柔嫩艾美尔球虫感染不同阶段鸡盲肠组织中关键候选miRNAs与免疫因子表达量之间的相关性进行了解析,筛选出球虫感染过程中与免疫因子表达显著相关的关键miRNA(即gga-miR-144-3p)并以此作为研究对象。在成功构建柔嫩艾美尔球虫子孢子侵染鸡DF-1细胞及HD11细胞体外球虫感染模型的基础上,探究gga-miR-144-3p在球虫感染中的具体调控功能。RTqPCR检测结果表明,在球虫感染的鸡盲肠组织及子孢子侵染的DF-1和HD11细胞中,gga-miR-144-3p的mRNA表达量均显著下降(P <0.05),验证了该miRNA在球虫感染过程中可能具有重要调控作用。体外功能试验表明,过表达gga-miR-144-3p能显著促进球虫子孢子侵染细胞中炎症因子IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α以及凋亡相关基因Caspase 3、Caspase 8、BIM、Bax的mRNA表达水平(P <0.05)。使用miRDB和TargetScan软件对gga-miR-144-3p靶向基因进行预测,并通过Venny 2.1.0取交集筛选共同预测靶基因,再经KEGG pathways和DAVID Bioinformatics对预测出的靶基因进行富集分析。最终预测出DUSP1为其潜在靶基因。通过RT-qPCR结果证实,在柔嫩艾美尔球虫感染鸡盲肠组织和子孢子侵染鸡DF-1细胞及HD11细胞中,DUSP1的mRNA表达水平极显著上调(P <0.01),与gga-miR-144-3p表达趋势相反。通过双荧光素酶检测进一步验证了gga-miR-144-3p与靶基因DUSP1之间存在靶向关系。同时,通过RTqPCR检测发现过表达gga-miR-144-3p能显著抑制细胞中DUSP1基因mRNA的转录水平,而干扰其表达则能显著促进细胞中DUSP1的表达水平上升(P <0.05)。进一步探究gga-miR-144-3p的靶向基因DUSP1在柔嫩艾美尔球虫感染过程中的调控功能。通过RTqPCR检测发现过表达DUSP1能够显著抑制正常细胞和球虫子孢子侵染细胞中炎症因子IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α以及促凋亡基因Caspase 3、Caspase 8、Bax的mRNA表达水平(P <0.05),而促进抗凋亡基因Bcl-2的表达水平(P <0.05);相反,干扰DUSP1的表达能显著促进柔嫩艾美尔球虫子孢子侵染鸡DF-1细胞及HD11细胞的炎症反应和细胞凋亡。另外流式细胞仪检测结果显示,过表达DUSP1能显著降低球虫子孢子侵染的细胞凋亡比例及存活细胞数量(P <0.05);干扰DUSP1则能显著促进细胞中凋亡基因的表达和凋亡细胞数量,提升细胞的存活率。综上,本研究系统筛选并揭示了柔嫩艾美尔球虫感染过程中一个关键miRNA调控分子(gga-miR-144-3p)的具体功能及其作用机制,即通过靶向抑制DUSP1的转录和翻译,进而促进柔嫩艾美尔球虫感染宿主的炎症反应和细胞凋亡。研究结果筛选了鸡球虫感染过程中的关键调控因子,为球虫病的诊断防治提供了参考。更多还原