lncWnt9a对鸡成肌细胞增殖、分化及脂质代谢的调控作用及其机制研究

【作者】 王子阳； 苏昶琪； 潘豫仙； 贺月华； 岳昕； 郑瑞； 司雪萌； 张怀勇； 陈文； 黄艳群；

【机构】 河南农业大学；

【摘要】 引言:近年来,越来越多的研究表明lncRNA在肌肉生长发育、脂肪沉积以及代谢性疾病中扮演着关键角色。肌细胞作为肉鸡生产性能的重要决定因素,其增殖、分化和脂代谢过程对肌肉生长和肉品质具有显著影响。前期转录组数据分析发现,lncRNA lncWnt9a在鸡腹腔注射胰岛素后胸肌组织中显著上调,并与血糖浓度表现出显著负相关性,提示其可能参与鸡肌肉组织的能量代谢及调控。因此,本研究旨在克隆lncWnt9a的全长序列,系统探究其对鸡原代成肌细胞的增殖、分化、迁移及脂质代谢等关键生物学过程的影响,并利用转录组学和RNA pulldown-MS技术初步揭示其调控网络,为深入理解鸡肌肉生长发育的调控机制提供新的理论依据。材料与方法:以11胚龄AA肉鸡胚蛋腿肌为材料,分离并培养鸡原代成肌细胞(Chicken primary myoblasts, CPM)。采用5’和3’端RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)技术克隆lncWnt9a全长序列。通过核质分离与qPCR分析lncWnt9a亚细胞定位。分别用不同浓度胰岛素和葡萄糖处理CPM,检测lncWnt9a表达变化。构建pcDNA3.1-lncWnt9a过表达载体及合成siRNA,并转染CPM以探究其功能。过表达lncWnt9a后进行转录组测序。利用RNA pulldown结合质谱分析筛选lncWnt9a结合蛋白。通过EdU、CCK-8及增殖相关基因qPCR检测细胞增殖;通过MyHC免疫荧光、分化相关基因qPCR分析细胞分化;通过细胞划痕试验检测迁移能力。通过油酸诱导建立细胞脂滴模型,结合油红O染色、脂滴荧光染色及脂代谢相关基因qPCR分析脂质积累;通过脂质过氧化检测试剂盒检测脂质过氧化。流式细胞术和彗星凝胶电泳分别分析细胞周期及DNA损伤情况。结果:课题组前期转录组分析发现lncRNA lncWnt9a在鸡注射胰岛素后于胸肌中显著上调(P<0.05),且其表达量与血糖水平显著负相关(R2=0.88,P<0.05)。RACE获得lncWnt9a全长序列2129 bp。表达谱分析显示lncWnt9a在肝、肾、肌肉中高表达,且不同发育阶段表达相对稳定。亚细胞定位分析显示其在细胞核、质均有分布。经胰岛素或葡萄糖诱导,lncWnt9a表达呈剂量依赖性上调(P<0.05)。lncWnt9a过表达后转录组筛出257个差异基因,KEGG富集于细胞黏附、脂代谢、细胞周期等通路,GO主要涉及动粒装配、有丝分裂及染色体分离,KOG注释至细胞周期调控、分裂及脂质代谢等。功能实验结果表明,lncWnt9a抑制CPM增殖、分化及脂代谢和脂质积累,促进脂质过氧化和细胞迁移,可致DNA损伤并阻滞G2/M期。RNA pulldown共鉴定271种lncWnt9a结合蛋白,其功能富集分析显示主要涉及核糖体、细胞骨架及代谢等生物学过程。讨论:本研究成功鉴定并表征了一个受胰岛素/葡萄糖信号调控的长链非编码RNA lncWnt9a。研究结果揭示了lncWnt9a在鸡成肌细胞中扮演着一个复杂的"调控枢纽"角色。一方面,它抑制细胞的增殖与分化,并将细胞周期阻滞于G2/M期,这表明lncWnt9a可能作为肌肉生长的"刹车"信号,防止细胞过度增殖,维持组织稳态。另一方面,它抑制了由油酸诱导的脂质积累,却促进了脂质过氧化和DNA损伤,暗示其可能参与了细胞在能量过剩状态下的应激反应与代谢重塑过程。机制上,转录组数据表明lncWnt9a的下游靶基因广泛参与细胞周期和脂代谢通路,这与我们的功能实验结果高度一致。更有意义的是,RNA pulldown-MS技术鉴定出的互作蛋白主要富集于核糖体、细胞骨架等关键功能复合体。这提示lncWnt9a可能通过直接结合蛋白,在转录后水平(如翻译调控)或通过影响细胞结构来发挥其生物学功能。本研究为解析鸡肌肉生长发育的精细调控网络提供了新的视角,并为未来通过分子育种改良肉鸡生产性能提供了潜在的新靶点。更多还原