整合全基因组重测序和转录组数据揭示TBX5调控广西地方鸡毛脚的分子机制

【作者】 刘雍翠； 杨祝良； 罗锦堂； 肖聪； 袁虹； 杜文娅； 杨秀荣；

【机构】 广西大学动物科学技术学院； 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室；

【摘要】 引言毛脚性状表现为胫部和脚趾的皮肤上覆有羽毛,在部分家禽和野生鸟类中能观察到。广西具有丰富的地方鸡品种,毛脚性状的变异大,有多毛脚品种、少毛脚品种和无毛脚品种,在同一品种内也存在多毛、少毛和无毛表型。因此,为进一步研究毛脚性状形成的遗传机理,本研究以广西地方鸡为试验材料,从基因组水平和转录组水平筛选毛脚性状的关键候选基因,并探索其在鸡胫部真皮成纤维细胞中的功能,为毛脚发育的生物学基础和遗传调控提供理论依据和数据支撑。材料与方法以6个广西地方鸡品种为研究对象,采集共1760只个体的血液用于基因组重测序,结合表型数据进行全基因组关联分析。同时收集不同毛脚表型个体的胫部、翅膀皮肤组织进行转录组测序和QRT-PCR验证,结合基因组数据鉴定关键候选基因。取龙胜凤鸡鸡胚(E7)的胫部皮肤用于真皮成纤维细胞的分离培养,并通过基因过表达和干扰以及EdU荧光染色、流式细胞术和迁移,验证关键候选基因的功能。结果根据全基因组关联分析鉴定到的位于Chr13和Chr15上的两个显著关联区域,注释到TBX3、TBX5和H2AFY等基因。通过RNA-seq和QRT-PCR,检测到TBX5在鳞片脚个体和毛脚个体的胫部中存在显著差异表达,表明其是影响毛脚的关键候选基因。在细胞水平上进行梯度过表达和干扰实验,结果显示适度过表达TBX5 (20 ng)时,细胞增殖相关基因的表达量显著上调。相反,TBX5过表达(2.5μg)和干扰TBX5后,均抑制增殖相关基因的表达,表明TBX5的功能与剂量有关。EdU荧光染色、流式细胞术和迁移实验表明,适度过表达TBX5可促进真皮成纤维细胞的增殖和迁移,而干扰TBX5则相反。讨论本研究中利用基因组和转录组数据筛选到关键候选基因TBX5。TBX5基因在鸡胚胎后肢发生异位表达,导致后肢部分翼状化且胫部鳞片向羽毛形态转化的情况;Domyan等人发现TBX5在有、无毛脚的鸽子前肢中无表达差异,但在毛脚个体的后肢中有表达。类似的,我们通过QRT-PCR检测到TBX5在有、无毛脚个体的前肢中无表达差异,但在毛脚个体的胫部皮肤组织中高表达,表明TBX5是影响广西地方鸡毛脚性状的关键基因。TBX5表达量在生长发育过程中受到精细调控,其剂量的增加或减少都会导致器官发生异常。我们通过梯度转染pEGFP-TBX5,发现随着过表达浓度的降低,细胞增殖先增加后减少,表明TBX5对毛脚发育具有剂量效应。因此,推测TBX5在后肢中适量异位表达会使胫部鳞片部分转化为毛囊,但不影响后肢形态发育。鸡胫部真皮层主要是成纤维细胞,研究表明在E6-8时期毛脚鸡的胫部真皮层细胞会迁移至表皮下方形成真皮聚结。通过细胞实验,我们发现适量过表达TBX5促进真皮成纤维细胞的增殖活性和迁移能力,而干扰TBX5则产生相反的结果,验证了TBX5基因对毛脚发育过程中真皮层细胞的真皮凝结这一生物学过程的促进作用。后续在鸡体内过表达或敲低TBX5后观察胫部表型变化,在组织学机制层面进一步探究TBX5对胫部毛脚发育的作用。更多还原