虾青素通过Nrf2/HO-1抑制铁死亡缓解奶牛乳腺炎损伤的研究

【作者】 苗雪； 陈鸿； 杨雯越； 邱迪； 任昊； 张璐瑶； 张建涛；

【机构】 东北农业大学动物医学学院黑龙江省动物疾病致病机制与比较医学重点实验室；

【摘要】 奶牛乳腺炎是对奶牛业危害最大的疾病之一,不仅对畜牧业造成巨大的经济损失,也会通过影响乳品质量进而危及人类健康。革兰氏阴性菌,特别是大肠杆菌是引起反刍动物乳腺炎的常见病原体之一。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要组成成分,可引起一系列细胞免疫反应,激活炎症信号,产生细胞因子和活性氧（ROS）。铁死亡是一种新的细胞死亡形式,与炎症性疾病有关,是一种铁依赖性脂质过氧化。已有研究表明,LPS可诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应与铁死亡,但具体机制尚不明确。虾青素（Astaxanthin,AST）是一种脂溶性类胡萝卜素,能够有效消灭ROS并清除自由基,具有抗氧化、抗衰老和抗癌等多重药理学作用。然而虾青素在乳腺炎发病过程中是否通过抑制乳腺上皮细胞铁死亡进而缓解乳腺炎症反应还有待探究。因此,本研究通过建立LPS诱导的小鼠乳腺炎体内模型和LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞系（MAC-T）炎症反应体外模型,系统的研究了虾青素、铁死亡与乳腺上皮细胞炎症之间的关系与调控机制。体内试验部分将40只哺乳期小鼠随机分为5组:对照组、模型组以及虾青素治疗组（低、中、高剂量）。虾青素低剂量组(10 mg·kg^-1)、中剂量组(25 mg·kg^-1)、高剂量组(50 mg·kg^-1)进行虾青素灌胃给药,对照组和模型组给予等量橄榄油,连续干预14 d。给药结束后,除对照组外,其余各组通过乳导管注射LPS构建小鼠乳腺炎模型,24h后收集乳腺组织样品。体外试验使用LPS诱导MAC-T建立奶牛乳腺炎体外模型,通过CCK8筛选虾青素的干预剂量。对乳腺组织进行H&E染色评估乳腺组织病理变化,免疫组化检测Occludin、GPX4和Nrf2通路相关蛋白水平;蛋白质免疫印迹方法检测乳腺组织及MAC-T细胞中铁死亡（GPX4、xCT和COX-2）和Nrf2通路相关蛋白水平;通过ELISA方法和MPO试剂盒检测乳腺组织和以及MAC-T细胞中炎症因子水平;通过MDA、铁离子试剂盒检测乳腺组织以及MAC-T细胞脂质过氧化和铁积累水平。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠乳腺腺泡内炎性细胞数量增多、铁积累增多、脂质过氧化增加和紧密连接蛋白减少。与模型组相比,虾青素处理组以剂量依赖性方式显著减轻了其造成的的炎性细胞浸润、铁积累和脂质过氧化水平;显著上调了紧密连接蛋白水平;显著上调了Nrf2和HO-1蛋白水平。细胞试验得到的结果与动物试验的结果相符。以上结果表明,虾青素预处理能够激活Nrf2/HO-1通路,缓解LPS诱导的乳腺组织及MAC-T细胞损伤和铁死亡水平,缓解乳腺炎症反应。更多还原