坏死梭杆菌激活TNFα/NF-κB/RUNX1通路诱导奶牛趾间皮肤炎症作用机制

【作者】 岳洋； 张安池； 于志莹； 徐恩爽； 葛延松； 郑家三；

【机构】 黑龙江八一农垦大学动物科技学院；

【摘要】 (目的)坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum subsp.necrophorum,Fnn)为革兰氏阴性、多形性杆状厌氧菌,呈长丝到短杆状,是奶牛腐蹄病中最常见的原发性病原体。前期研究证实了腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白互作网络与炎症信号通路密切相关,但调控机制仍不明确。本研究将探究趾间皮肤和成纤维细胞中的TNFα-TNFR1/NF-κB/RUNX1信号通路在Fnn诱导奶牛趾间皮肤炎症中的作用。(方法)(1)构建Fnn诱导奶牛趾间皮肤外植体模型,使用TNFα-TNFR1通路抑制剂(CAY10500)及RUNX1抑制剂(Ro5-3335)干预,通过病理组织学检测、免疫组化、Western Blot法评价Fnn感染对奶牛趾间皮肤外植体的影响以及TNFα-TNFR1/NF-κB信号通路在其中发挥的作用。(2)建立Fnn感染体外成纤维细胞模型:以不同MOI的Fnn (0:1、25:1、50:1、75:1、100:1、200:1、400:1)处理真皮成纤维细胞0h、3h、6h、12 h和24 h后,采用CCK-8细胞增殖试剂盒评估细胞活力,EdU染色标记新增殖的细胞,筛选出最适MOI及最佳感染时间,并通过细胞划痕试验检测Fnn对成纤维细胞迁移能力的影响,Western blot法检测细胞中TNF-α、RUNX1的蛋白表达水平。(结果)(1)组织病理学结果显示CON组皮肤组织的表皮完整,各层结构清晰,Fnn组皮肤组织可见局部角质层增厚,少量的毛囊、皮脂腺坏死,真皮层的皮脂腺周围可见淋巴细胞浸润;加入CAY10500抑制剂和Ro5-3335后可缓解上述病理变化;免疫组化结果显示与CON组相比,Fnn组皮肤组织中TNFR1蛋白的表达水平极显著上升(P<0.01),与Fnn组相比,Fnn+CAY10500抑制剂组皮肤组织中TNFR1蛋白极显著下降(P<0.01),单独抑制剂组CAY10500与对照组相比无显著性差异,RUNX1的表达结果趋势同TNFR1;Western Blot结果显示Fnn使促炎细胞因子IL-1β、TNF-α显著升高、抑炎因子IL-10显著降低,加入抑制剂CAY10500能够阻断TNF-α介导的NF-κB信号通路活化,并降低RUNX1的蛋白表达(P<0.01)。(2) CCK-8细胞活力检测显示成纤维细胞活力随着Fnn MOI和时间的增加而下降;EdU检测坏死杆菌感染蹄真皮成纤维细胞不同时间的细胞活性,结果发现感染3 h后MOI大于400无新增细胞、感染12h后MOI大于200无新增细胞、感染24 h后MOI大于100无新增细胞,且多为破碎的细胞核。Western blot结果显示TNF-α、RUNX1的蛋白表达水平随时间升高;最终筛选出Fnn最佳MOI为75:1,最佳感染时间为12 h。(结论)结果表明Fnn通过激活TNFα/NF-κB/RUNX1通路诱导奶牛趾间皮肤发生炎症反应。更多还原