KN93长时间处理引起神经元超兴奋性的机制

【作者】 梁洪玥； 孟雨露； 佟欣； 李美旋； 郭凤；

【机构】 中国医科大学药学院临床药理学教研室； 中国医科大学药学院药物毒理学教研室； 中国医科大学附属第四医院药学部；

【摘要】 目的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMK Ⅱ）是一种由Ca²⁺或钙调蛋白（Calmodulin,CaM）激活的多功能蛋白激酶,在大脑中高表达。既往研究表明,CaMK Ⅱ是神经元形成和认知功能的主要调节因子,在包括癫痫在内的神经元超兴奋性相关疾病中发挥重要作用,其特异性抑制剂KN93短时间处理（≤1小时）发挥保护神经元的作用,然而KN93长时间处理（≥24小时）的作用尚不清楚。本研究通过探究KN93对神经元兴奋性的影响,为神经元超兴奋性疾病发病机制的研究提供新思路与新方向。材料和方法:（1）应用脑电图技术检测侧脑室注射CaMK Ⅱ特异性抑制剂KN93长时间处理（24小时）的正常Wistar大鼠和遗传性癫痫动物震颤（Tremor,TRM）大鼠的脑电波。（2）应用膜片钳技术检测KN93长时间处理或CaMK ⅡshRNA慢病毒感染的培养原代海马神经元的动作电位。（3）应用微电极阵列技术检测KN93长时间处理的培养人诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cell,hiPSC）分化皮层神经元的自发放电活动。（4）分别应用免疫共沉淀和免疫荧光染色检测KN93处理或CaMK ⅡshRNA慢病毒感染的大鼠海马组织和培养原代海马神经元Na_V1.2和CaM的相互作用。（5）应用pull-down技术检测新型多肽ACNp对CaM与Na_V1.2"IQ"结构域结合的影响。（6）分别应用脑电图和膜片钳技术检测新型多肽ACNp对KN93处理诱导的神经元超兴奋性的影响。结果:（1） KN93长时间处理诱导正常Wistar大鼠和TRM大鼠出现癫痫样脑电波。（2） KN93长时间处理和CaMK Ⅱ基因干扰均导致培养原代海马神经元兴奋性增加。（3） KN93长时间处理引起培养hiPSC分化皮层神经元自发放电活动增强。（4） KN93长时间处理和CaMK Ⅱ基因干扰均引起培养原代海马神经元Na_V1.2和CaM的相互作用增强。（5）新型多肽ACNp在体外拮抗CaM和Na_V1.2"IQ"结构域的结合。（6）新型多肽ACNp减少KN93长时间处理引起的体内外神经元超兴奋性。结论:本研究阐明持续性抑制CaMK Ⅱ引起神经元超兴奋性,这可能是包括癫痫在内的神经元超兴奋性相关疾病的重要发病机制之一,为研究持续性抑制CaMK Ⅱ与神经元兴奋性之间的关系奠定新的理论与实践基础。更多还原