重组酶介导等温扩增技术在家蚕微孢子虫检测中的应用与评价

【作者】 唐名艳； 唐亮； 董桂清； 黄深惠； 孟宪志； 蒋满贵； 胡文娟； 潘国庆；

【机构】 广西壮族自治区蚕业技术推广站； 西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室；

【摘要】 现行桑蚕种检验规程采用传统显微镜法检测母蛾和成品卵中的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb),但存在检测灵敏度低且检测周期长的问题。重组酶介导链置换核酸扩增(Recombinase-aid Amplification,RAA)技术方法简单、检测快速,可应用于蚕业生产中家蚕微孢子虫的快速检测。为评价RAA技术在检测家蚕蚕卵中家蚕微孢子虫的应用价值,于5龄第3 d,用低(40个孢子/头蚕)、中(400个孢子/头蚕)、高(4000个孢子/头蚕)剂量的Nb孢子添食感染原种932×芙蓉(9·芙)、7532×湘晖(7·湘),然后将感染母蛾与健康雄蛾交配产卵,产卵后的母蛾单蛾研磨后用光学显微镜检测并按高带毒(>2.5×106个孢子/蛾)、低带毒(104～2.5×106个孢子/蛾)、镜检"无毒"(<104个孢子/蛾)分类标记,抽取每个攻毒剂量下不同带毒程度的母蛾各4只,将其所产蚕卵即时浸酸后催青72 h,采用重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)、量子点层析核酸检测试纸条(QNALFS)、实时荧光定量PCR(qPCR)3种分子检测方法检测母蛾Nb胚胎感染率。每个母蛾每种检测方法各检测30粒(单粒卵检测),比较3种方法检出率的差异。试验结果:qPCR、RAA、QNALFS检测9·芙3个剂量下所有抽取的母蛾的平均胚胎感染率分别为61.67%、45.0%、21.67%,检测7·湘平均胚胎感染率分别为70.0%、48.34%、23.33%。qPCR检出率最高,其次是RAA检测方法,QNALFS检出率最低。但qPCR和RAA两者检出率差异不显著,但均显著高于QNALFS。研究结果表明:RAA检测操作简单、检测快速,RAA只需加基因组提取液研磨后简单离心即可作为反应模板进行核酸扩增,上样后仅需20 min即可完成恒温扩增和实时检测荧光判定结果,且检出率与qPCR方法相当,因此具有较好地应用前景。更多还原