外源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙株的全基因组特征分析及病毒粒子包装

【作者】 张培； 王宇； 刘淑英；

【机构】 内蒙古农业大学兽医学院； 内蒙古自治区草食家畜兽医基础与疫病防控重点实验室；

【摘要】 绵羊肺腺瘤(Ovine Pulmonary Adenocarcinoma,OPA)是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(exogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus,exJSRV)引起的一种传染性肺部肿瘤疾病,该病潜伏期可达数月至数年且传播性较强,持续损害养羊业的发展,因此解析该病原体的基因组对于制定OPA防控措施有重要意义。然而,由于内源性绵羊肺腺瘤病毒(enogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus,enJSRV)的干扰,exJSRV全基因组序列的获取具有一定挑战性,本研究首先通过U3半巢式PCR结合密度梯度离心法纯化目标病毒粒子,其次利用内外源基因组的低同源区域设计特异性逆转录引物,最后结合长片段PCR及3’RACE技术扩增exJSRV基因组序列,结果显示成功获得内蒙古地区ex JSRV的全长基因组序列,并上传至GenBank,序列号为ON204347。序列分析显示,内蒙株NMJS12在长末端重复序列LTR-U3区、gagVR1/VR2及env-VR3区域呈现典型的exJSRV分子特征,其与新疆株JSRV-C1的同源性为98.8%,显著高于国外的exJSRV(93.05%-95.84%)及所有的enJSRV(88.73%-92.26%)。遗传进化分析显示,NMJS12株与外源性JSRV-C1株处于同一进化支。基于前期研究基础,将全长基因组序列克隆至真核表达载体pc DNA4.0中,通过将5’端LTR的U3区域替换为人巨细胞病毒(CMV)强启动子,成功构建重组质粒pc-NMJS12。采用脂质体转染法将该重组质粒导入293T细胞后,利用透射电镜观察病毒粒子特征,结果显示,与空白对照组相比,转染组细胞中可见直径为75-89 nm的完整圆形病毒颗粒,其核心内电子密度高于胞质,证实衣壳结构的完整性;同时观察到病毒粒子通过质膜完成出芽过程,符合逆转录病毒的典型形态学特征。综上所述,本研究首次系统阐明了内蒙古地区exJSRV(NMJS12)的完整基因组序列关键分子特征,成功实现病毒粒子的体外包装并初步证实了NMJS12株的生物活性,为后续感染性分子克隆及解析病毒致病机制提供重要技术支撑。更多还原