弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白的鉴定及其功能机制研究

【作者】 李森阳； 钱佳惠； 杨静； 何政明； 赵童节； 赵俊龙； 方瑞；

【机构】 华中农业大学；

【摘要】 弓形虫作为一种胞内寄生原虫,在入侵宿主细胞及胞内复制过程中需要大量的分泌蛋白在内质网中进行加工折叠,但是目前关于弓形虫内质网是否需要ATP以及ATP如何进入内质网仍不得而知。因此我们的目的是寻找并鉴定弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白,阐明其对弓形虫生长发育的影响,为进一步理解弓形虫的生长调控机制提供理论依据。本研究通过序列比对等方法寻找到潜在的内质网ATP/ADP转运蛋白,通过同位素标记、异源回补等方法验证ATP转运能力;通过Teto/off条件性敲除系统研究TgANT在弓形虫生长发育过程中发挥的作用。结果显示,我们成功筛选到一个定位于内质网的潜在的ATP/ADP转运蛋白TgANT。在大肠杆菌异源表达系统中使用³²P-ATP的转运实验证明TgANT确实是弓形虫内质网中的ATP/ADP转运蛋白,并且具有底物特异性。使用Teto/off条件性敲除系统将TgANT基因关闭后,弓形虫复制能力显著降低,不形成可视化空斑,并且入侵能力显著降低,入侵相关的分泌蛋白MIC2表达量显著降低。与此同时,内质网应激标志性蛋白TgIF2α磷酸化水以及BIP蛋白表达量均显著升高,TUNEL检测DNA损伤提示我们内质网ATP的缺失导致了弓形虫的调亡。综上,TgANT是弓形虫内质网中的ATP/ADP转运蛋白,其缺失导致弓形虫内质网ATP供应中断,引发不可逆转的内质网应激进而弓形虫死亡。更多还原