wbkD基因缺失影响猪种布鲁氏菌LPS合成能力和毒力

【作者】 王鑫； 刘郁夫； 孙佳丽； 冯宇； 彭小薇； 陈瑞爱； 丁家波；

【机构】 中国兽医药品监察所国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室； 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司； 华南农业大学兽医学院；

【摘要】 wbkD基因在布鲁氏菌中编码一种糖基转移酶,参与合成布鲁氏菌LPS的O侧链。为探究wbkD基因与布鲁氏菌LPS合成和毒力之间的关系。利用同源重组技术,构建猪种布鲁氏菌wbkD基因敲除自杀载体质粒,经电转获得猪种布鲁氏菌S2株的wbkD基因缺失株;将缺失株连同亲本株分别以1×10⁶ CFU/ml接种TSB培养基进行37℃振荡培养,每隔8小时取样计数,研究缺失株的生长速度和表型变化;通过吖啶黄凝集试验、结晶紫染色、细菌LPS银染分析比较亲本株和缺失株之间LPS合成能力的差异;进一步将缺失株和亲本株以MOI=100的剂量感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,检测其不同时间（48h,72h）细菌存活情况,同时将缺失株和亲本株以1×10⁵ CFU/只的剂量腹股沟皮下注射4-6周龄BALB/c小鼠感染试验,每隔1周剖杀5只,进行脾脏称重和细菌分离,确定其定殖情况,从体外和体内情况下分析分析wbkD基因缺失对细菌毒力的影响。经PCR及测序验证,成功构建猪种布鲁氏菌wbkD基因缺失株;细菌振荡培养后,不同时间点缺失株和亲本株平板上细菌形态、计数均无差异,但wbkD基因缺失导致猪种布鲁氏菌由光滑表型转变为粗糙表型,感染后48 h和72 h,ΔwbkD的细胞内存活能力显著弱于亲本株（P<0.001）,小鼠感染试验进一步证实,在相同的感染剂量下,感染后1周和4周,ΔwbkD感染组小鼠脾脏载菌量仅为10^3.53CFU/spleen和10^3.42 CFU/spleen,显著低于亲本株(10^7.07 CFU/spleen,10^5.91CFU/spleen),并且AwbkD感染组的小鼠脾脏重量显著低于亲本株。wbkD基因是布鲁氏菌合成LPS过程中的关键基因,wbkD基因缺失导致布鲁氏菌毒力致弱,本研究可为进一步筛选布病疫苗分子修饰靶点提供参考。更多还原