APEC-OMV及其关键毒力因子OmpA对感染细胞致病性研究

【作者】 涂健； 李芳果； 阮健铭； 祁克宗；

【机构】 安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控重点实验室；

【摘要】 研究目的:禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)作为肠道外病原菌具有广泛的宿主谱,不仅是严重危害养禽业的重要病原菌,而且对人类健康造成巨大的潜在威胁,其防治是目前的世界性难题。病原菌在自然生长和感染宿主过程中,可分泌纳米级外膜囊泡(Outer Membrane Vesicle,OMV),OMV是病原菌极为重要的毒力载体,部分病原菌OMV本身就具有感染性和致病性,可在感染宿主体内通过血脑屏障自由迁移导致宿主感染,成为不依赖源细菌的新的病原体,针对病原菌OMV致病机制的研究已成为热点。但目前针对禽致病性大肠杆菌OMV (APEC-OMV)致病机制研究尚未见系统报道,部分重要的科学问题未能明确解答:如与纯培养相比,APEC在感染宿主过程后OMV的组分是否发生变化;APEC-OMV本身是否具有致病性;APEC-OMV被内化到宿主细胞后与细胞哪些蛋白发生互作反应,其调控通路是什么?针对上述科学问题,本论文开展了相关研究如下:研究方法:(1)采用超滤浓缩法及密度梯度离心法提取APEC感染DF-1细胞前后的OMV,通过Label-free蛋白质谱技术进行差异蛋白质组分分析。(2)将提取纯化的APEC-OMV与鸡气管黏膜上皮细胞共培养及肌肉注射30日龄鸡体中,通过细胞毒性试验、细胞凋亡荧光检测、流式细胞仪检测及组织病理学观察等方法,分析APEC-OMV对鸡气管组织的体内外致病性。(3)基于APEC-OMV蛋白组学分析的关键毒力因子外膜蛋白A (OmpA),构建pCMV-Myc-OmpA真核重组表达载体,建立OmpA感染鸡气管黏膜上皮细胞模型,应用激光共聚焦及免疫荧光技术检测OmpA在细胞内的共定位情况,应用qRT-PCR方法检测感染上皮细胞天然免疫基因的转录水平。研究结果:(1) APEC感染DF-1细胞前后的蛋白组学差异分析结果:成功建立APEC-OMV提取纯化方法。APEC感染DF-1细胞前后提取纯化的APEC-OMV蛋白质组分存在明显差异,共筛选到659个显著差异蛋白,其中上调蛋白330个,下调蛋白329个;KEGG通路分析显示差异蛋白主要富集在核糖体、细胞外基质、O-聚糖生物合成、氧化磷酸化、内质网蛋白质加工和细胞粘附分子等通路。(2) APEC-OMV对气管组织体内外致病性观察结果:将提取纯化的APEC-OMV与鸡气管黏膜上皮细胞共培养后结果表明:APEC-OMV可明显致上皮细胞凋亡,其细胞凋亡率呈明显的浓度依赖性,即随着APEC-OMV浓度增加,致鸡气管黏膜上皮细胞凋亡率越高;将提取纯化的APEC-OMV注射到鸡体内观察气管组织结果表明:APEC-OMV可致鸡气管黏膜出现明显损伤,锥形体细胞凋亡、坏死。(3) APEC-OMV关键毒力因子OmpA对鸡气管上皮细胞天然免疫调控检测结果:成功建立APEC-OMV的关键毒力因子OmpA感染鸡气管黏膜上皮细胞模型,OmpA在感染上皮细胞内主要定位在细胞质中,可诱导感染细胞发生早期凋亡;OmpA可导致感染上皮细胞天然免疫基因中IL-6、MDA5、STING、IRF7、NLRP3、IFN-α、IFN-β、TLR3表达水平显著上调,IL-1β、NF-κβ、MAVS表达水平发生下调。结论:(1)与纯培养相比,APEC在感染DF-1细胞后的APEC-OMV蛋白质组分存在显著差异;(2)通过体内外感染实验发现:APEC-OMV对鸡气管黏膜上皮细胞及鸡气管组织均具有致凋亡、坏死作用;(3) APEC-OMV关键毒力因子OmpA主要定位在感染细胞的细胞质中,可致感染细胞早期凋亡,可导致感染细胞的天然免疫基因表达差异。更多还原