利用实时荧光定量方法进行副猪嗜血杆菌分子血清分型的研究

【作者】 崔一芳； 郭芳芳； 蔡旭旺； 曹晓亚； 王宏俊； 杨兵； 周宏专； 苏霞； 徐福洲；

【机构】 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京市农林科学院畜牧兽医研究所； 农业微生物学国家重点实验室,华中农业大学动物医学院；

【摘要】 副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)是引起猪格拉泽氏病(Gl?sser’s disease)的细菌性病原,可感染猪出现多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎及败血症等多种临床表现和病理变化,是当前我国养猪业最重要的细菌性疫病之一。GPS目前至少鉴定出15个血清型,不同血清型菌株存在高毒力、中等毒力和无毒力等显著差异,因而鉴定GPS血清型对该病的诊断、防治以及流行病学调查具有重要意义。通过对GPS 15个血清型荚膜多糖合成编码基因座的基因结构进行分析发现,不同血清型菌株之间存在显著差异,基于不同血清型的特异性基因进行多重PCR的分子血清分型方法已有报道,此种分子血清分型方法比传统的血清分型方法具有高效、准确、快速等显著优势。为克服多重PCR方法中需要跑胶、通过条带判断时不易区分大小等缺点,本试验建立了一种简便、快速的基于实时荧光定量(qPCR)检测方法中Ct值大小进行GPS血清型判定的检测方法,即利用报道的GPS不同血清型特异性基因片段,设计不同血清型的特异性qPCR引物,建立基于Sybr Green荧光染色的qPCR检测方法。通过对GPS15种血清型国际参考菌株检测结果显示,对应血清型菌株的Ct值均小于12,而其它血清型菌株均大于19,扩增效率介于85.5%至110.4%之间,相关系数R~2>0.98。通过对83个临床分离株检测结果显示,本试验建立的qPCR与多重PCR检测方法符合率为98.8%(82/83),其中经琼脂扩散试验(GID)鉴定的43株血清型菌株中41株与qPCR检测结果相符,2株血清12型菌株被鉴定为血清5型。本试验结果显示,基于Ct值的实时荧光定量检测方法应用于GPS分子血清分型具有简便、快速、准确等显著优点,对临床上GPS流行病学调查、快速诊断和防控具有重要的应用价值。更多还原