番茄斑驳花叶病毒葫芦岛分离物侵染性克隆的构建及致病力分析

【作者】 陈红伟； 王妍； 王志平； 夏子豪； 吴元华； 安梦楠；

【机构】 沈阳农业大学植物保护学院；

【摘要】 番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)为近年来发现的一种烟草花叶病毒属新成员,是茄科作物上危害严重的主要病毒之一,近几年EPPO全球数据库报道多个国家从进境辣椒和番茄种子中截获该病毒。侵染性克隆技术是研究病毒致病机理的重要工具,本研究首先从葫芦岛地区番茄病叶上检测出ToMMV,将其全长分为3段(1～2 814 bp、2 794～4 730 bp、4 710～6 400 bp)扩增并测序得到ToMMV葫芦岛分离物(ToMMV-HLD)的全基因序列;利用同源重组连接酶将ToMMV-HLD全长序列插入到pCB301表达载体的35s启动子和HDV核酶之间,成功构建了其全长cDNA侵染性克隆pToMMV-HLD;在Genbank中根据序列同源性进行BLAST比对,发现其与ToMMV-GD-2020全基因序列同源性最高,为99.87%。通过农杆菌注射接种本生烟,结果显示,在10～14 dpi,本生烟系统叶均出现褪绿等症状;并取浸润本生烟的上部叶片作为ToMMV-HLD毒源,采用机械摩擦的方法接种到本生烟植株,于14 dpi观察到本生烟新生嫩叶出现明显萎蔫褪绿、皱缩等症状。经实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测,侵染性克隆pToMMV-HLD在本生烟中的侵染率达100%。构建携带绿色荧光蛋白GFP报告基因的植物病毒表达载体,可以观察到病毒在植物体内的运动和积累。本研究利用同源重组技术,基于ToMMV全长cDNA侵染性克隆pToMMV-HLD,分别采用重复的包括79 bp和250 bp CP亚基因组启动子策略构建含GFP的ToMMV病毒表达载体pToMMV-GFP和pToMMV-GFP-79,通过农杆菌注射接种本生烟植株,8 dpi使用便携式紫外灯(UV)进行观察未发现明显的绿色荧光。拟查找原因继续构建表达GFP的ToMMV突变载体的载体,为后续开展ToMMV病毒基因功能及其致病机制的研究奠定基础。更多还原