【作者】 张漫； 陈晓娇； 赵亚杰； 谭桂玉； 王保民；

【Author】 Zhang Man;Chen Xiaojiao;Zhao Yajie;Tan Guiyu;Wang Baomin;College of Agronomy,China Agricultural University;

【机构】 中国农业大学农学院；

【摘要】 细胞分裂素（CTKs）是腺嘌呤N6位取代基的衍生物。根据取代基的不同,分为异戊烯基型和芳香性。植物体内异戊烯基型细胞分离素主要有反式玉米素（tZ）、玉米素核苷（tZR）、二氢玉米素（DHZ）、二氢玉米素核苷（DHZR）、异戊烯基腺嘌呤（IP）、异戊烯基腺嘌呤核苷（IPA）、顺式玉米素（cZ）、顺式玉米素核苷（cZR）。细胞分裂素在新鲜的植物组织中含量极低,为pmol·g^-1,检测时易受杂质干扰,因此识别和定量检测细胞分裂素极为困难。现在常用的检测细胞分裂素的方法为LC-MS以及GC-MS,这些方法均需要复杂的样品前处理方法,如固相萃取法、固相微萃取、免疫亲和层析法（IAC）以及强离子交换柱等。本研究用ZR单克隆抗体制备亲和层析柱用于样品前处理并进行高效液相色谱串联质谱进行实际样品的检测。（1）制备了ZR细胞分裂素的单克隆抗体用于后续免疫亲和层析柱的制备。分别测定了ZR、Z、DHZR、DHZ、IPA、IP与ZR抗体的交叉反应率,分别为100.0%,104.3%,31.4%,31.3%,1.1%,0.7%。（2）测定了ZR柱的柱容量,当标样ZR、Z、DHZR、DHZ、IPA、IP上样量为100 ng时,ZR免疫亲和柱对IP和IPA的吸附量为3.5和17.4 ng,对其他标样吸附量为68.6～99.6 ng。选择一系列梯度的标样ZR、Z、DHZR、DHZ、IPA、IP进行免疫亲和柱的附载洗脱,用以确定ZR免疫亲和柱的最低上样量和各标样的洗脱效率。混合标样ZR、Z、DHZR、DHZ、IPA、IP上样量分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 ng,所有标样LC-MS测定的洗脱效率:Z为78.6%～114.4%,ZR为95.3%～106.0%,DHZ为91.7%～111.0%,DHZR为94.9%～115.5%;当IP上样量小于3.5 ng时,IP的洗脱效率为42.3%～95.7%,IPA的洗脱效率为66.9%～114.3%。由于植物体内（鲜物质质量）IP含量均少于3.5 ng·g^-1,所以ZR免疫亲和柱可以用于植物样品中6中细胞分离素的分离纯化。（3）使用C18固相萃取小柱（C18）、ZR免疫亲和柱IAC（ZR IAC）、C18-ZR IAC柱串联,纯化棉花幼苗根部样品。结果发现样品经C18柱纯化后,质谱图中显示杂质干扰较多;而样品经ZR-IAC和过C18-ZR IAC串联柱纯化后,样品中杂质干扰显著降低,二者降低效果相同。因此,只选用免疫亲和柱进行样品前处理。（4）DPC浸种处理棉花根部样品,用ZR免疫亲和柱纯化后用LC-MS检测细胞分裂素含量。结果显示,DPC浸种处理12 h后,Z、ZR、IP、IPA、DHZ、DHZR的含量分别为0.75、6.40、0.08、1.42、0.05、0.09 ng·g^-1;蒸馏水处理12 h后,Z、ZR、IP、IPA、DHZ、DHZR的含量分别为0.79、4.63、0.13、1.34、0.05、0.07 ng·g^-1。活性细胞分裂素Z、IP、DHZ的含量与对照相当或略微降低,储藏型的细胞分裂素ZR、IPA、DHZR略微升高。（5）前人研究表明,IAA/自由态CTKs比例增加是促进根系发生的主要原因。DPC浸种处理能显著促进棉花根部侧根的发生。我们先前的研究表明DPC浸种可以显著增加棉花根中自由态IAA的含量。本研究测定结果发现,与对照相比各种自由态细胞分裂素的含量变化不大。因此,IAA/CTKs的比例增大主要是自由态IAA的含量增加导致的。更多还原