棉花中高效特异的CRISPR/Cas9系统的建立

【作者】 王鹏程； 张军； 孙琳； 马益赞； 徐娇； 梁思佳； 邓晋武； 谭家福； 张清华； 涂礼莉； 金双侠； 张献龙；

【机构】 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室；

【摘要】 CRISPR/Cas9系统是近年来快速发展的基因组编辑技术,能够实现基因的定点编辑,因其高效性和灵活性而广受研究者青睐。该技术的主要应用是创造特定基因的突变体并用于功能基因的遗传研究,因此在棉花中创建CRISPR/Cas9系统能加快棉花基因功能的研究进展。在棉花中克隆到与拟南芥AtU6-26同源的U6启动子,用于改造能够同时串联多个sgRNA靶标的CRISPR/Cas9表达载体。分别对棉花中异源表达的基因DsRED2和棉花内源基因GhCLA1设计多个sgRNA打靶位点,构建载体并进行棉花遗传转化。结果表明,靶向DsRED2的6个sgRNA位点产生以碱基缺失为主的基因编辑。DsRED2基因被敲除的棉花在各个组织中均丢失了红色荧光,红色种子也恢复成野生型状态。遗传分析发现,T0代产生的突变基因型和表型均能够稳定遗传至T1代,而且对没突变的位点能产生持续编辑。靶向GfhCLA1的4个sgRNA也产生以碱基缺失为主的突变,2个sgRNA作用能够产生大片段缺失。Gh CLA1基因被敲除后产生明显的白化植株,生长发育受到严重的影响,该表型产生效率达到75%。通过分析多个单株的靶标位点基因型和表型发现,产生完全白化的表型需要敲除GfhCLA1的所有拷贝。通过设计Barcode标签标记目的基因的检测引物,结合高通量测序技术,完成对30个单株的突变检测,显著提高突变体单株的检测效率。同时利用高通量测序方法检测26个潜在脱靶位点,没有发现脱靶效应。表明该CRISPR/Cas9系统在棉花中能够高效地和特异地实现基因组编辑,为后续创建棉花突变体群体打下基础。更多还原