tiRNA-Val-CAC-002靶向ITGB3/PI3K/AKT通路激活FB自噬的机制研究

【作者】 彭慧； 孙磊叶； 喻晖乔； 吴颖芳；

【机构】 中南大学湘雅医院口腔医学中心；

【摘要】 目的:槟榔碱所致的成纤维细胞(Fibroblast,FB)活化是口腔黏膜下纤维性变(Oral submucous fibrosis,OSF)发病过程中重要的病理现象。本课题前期研究证实,OSF组织及槟榔碱刺激FB中tiRNA-Val-CAC-002高表达,并且槟榔碱可以通过上调tiRNA-Val-CAC-002促进FB自噬进而促进FB活化。但tiRNA-Val-CAC-002调控FB自噬的具体分子机制尚不明确。本课题旨在探究tiRNA-Val-CAC-002调控FB自噬进而促进其活化的具体分子机制,以求进一步阐明OSF发病机制并寻求OSF治疗有效靶点。方法:(1)拟合TargetScan和miRanda算法,利用生物信息软件对tiRNA-Val-CAC-002的靶基因进行预测。(2) KEGG对预测的靶基因进行富集分析,筛选靶基因及信号通路。(3)免疫组织化学染色法检测OSF组织中靶基因及信号通路关键分子的表达。(4)在FB中转染tiRNA-Val-CAC-002 mimic/inhibitor,RT-qPCR检测下游靶基因的表达,并利用双荧光素酶报告基因实验验证tiRNA-Val-CAC-002是否直接靶向调控下游靶基因的表达。(5) Western Blot检测槟榔碱、tiRNA-Val-CAC-002及两者联合作用下FB中通路相关蛋白的表达。结果:(1)生物信息学分析表明ITGB3是tiRNA-Val-CAC-002的靶基因之一,且与tiRNA-Val-CAC-002在其mRNA的8-mer-1a位点上反向互补结合。(2) KEGG信号通路分析显示:tiRNA-Val-CAC-002在多种通路中发生改变,其中与自噬经典通路PI3K/AKT最为相关。(3) OSF组织中ITGB3、p-AKT低表达。(4)双荧光素酶报告基因实验结果显示:tiRNA-Val-CAC-002可显著降低ITGB3-WT萤光素酶活性(P<0.01),对ITGB3-MUT荧光素酶活性没有影响(P>0.05)。(5)槟榔碱、tiRNA-Val-CAC-002单独作用于FB时,可降低FB中ITGB3/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达(P<0.05);而抑制tiRNA-Val-CAC-002则可促进ITGB3/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达,并且,抑制tiRNA-Val-CAC-002可逆转槟榔碱导致的ITGB3/PI3K/AKT通路相关蛋白表达降低(P<0.05)。结论:槟榔碱可能通过上调tiRNA-Val-CAC-002,抑制ITGB3/PI3K/AKT通路,激活FB自噬,促进胶原纤维的表达,从而导致OSF的发生发展。更多还原