Luminex技术检测KIR3DL1与其配基HLA-Bw4相互作用方法的建立

【作者】 陶苏丹； 王洁琳； 朱发明； 何吉；

【机构】 浙江省血液中心；

【摘要】 目的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immunoglobulin-like Receptor,KIR)主要表达于NK细胞和部分T细胞表面,通过与靶细胞表面HLA-Ⅰ类分子(配基)相互作用传导抑制或激活信号来调控NK细胞活性,在NK细胞免疫杀伤及抗白血病效应上起重要作用。KIR与HLA均为高度多态性的分子,它们之间的相互作用存在强弱差异,诱导的NK细胞活性也存在差异。然而,大多数的KIR和HLA相互作用强度尚不清楚,而且国内尚无检测其相互作用的方法,无法指导NK细胞在免疫治疗中的应用。为了解决以上问题,本文通过将KIR3DL1胞外结构域与人IgG-Fc段融合表达,利用商品化偶联97种HLA-Ⅰ类分子的磁珠和Luminex液相芯片平台,建立Luminex技术检测KIR3DL1与其配基HLA-Bw4相互作用。方法根据中国汉族人群中分布频率最高的KIR3DL1*01502基因编码区序列,设计特异性引物扩增并获取KIR3DL1*01502胞外结构域和stem区域(1-319个密码子),与pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接,构建并筛选获得KIR3DL1*01502-IgG-Fc重组质粒,并转染人胚胎肾细胞293(HEK293),获得稳定表达细胞株。提取重组蛋白,利用Protein A/G混合柱料纯化树脂对重组蛋白进行纯化并western-blot鉴定。将获得的KIR3DL1*01502-IgG-Fc融合重组蛋白与HLA CLASS-Ⅰ商品化磁珠反应,根据FlexXMAP3D仪读取的荧光值判断KIR3DL1*01502与配基HLA-Bw4的反应强度。空质粒转染的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞提取的蛋白与HLA CLASS-Ⅰ磁珠反应做阴性对照。结果在转染的HEK293稳定表达细胞株细胞上清和细胞质膜内均检测到KIR3DL1*01502-IgG-Fc融合重组蛋白的表达。Luminex结果显示,KIR3DL1*01502-IgG-Fc和不同的HLA分子编码的HLA-Bw4具有不同的相互作用强度,与HLA-A*23:01和HLA-A*25:01几乎检测不到阳性信号;与HLA-A*24:02、HLA-A*24:03、HLA-B*37:01、HLA-B*44:03和HLA-B*13:02相互作用的荧光强度为弱阳性;而与其它HLA-Bw4分子,如HLA-B*44:02、HLA-B*49:01、HLA-B*51:01、HLA-B*53:01、HLA-B*57:01和HLA-B*57:03反应表现出较强的荧光信号。KIR3DL1*01502-IgG-Fc融合重组蛋白与其它不编码HLA-Bw4的微球反应均呈阴性。空质粒转染的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞提取的蛋白与HLA CLASS-Ⅰ所有磁珠反应也均为阴性。结论本文通过体外表达KIR3DL1*01502胞外结构域和人IgG-Fc段融合重组蛋白,利用Luminex技术检测KIR3DL1*01502与HLA-Bw4配基的相互作用。结果显示阴性对照与所有磁珠反应结果和KIR3DL1*01502与不是其配基的HLA磁珠反应结果均阴性,说明该方法具有一定的特异性。荧光结果显示KIR3DL1*01502与不同的HLA分子编码的配基反应荧光强度有强弱,说明该方法可以成功检测KIR与HLA-Ⅰ类分子的相互作用。该方法的建立为检测KIR与HLA-Ⅰ类分子的相互作用提供了一种简便可行的方法,对预测NK细胞和T细胞在其KIR识别HLA-Ⅰ类分子及对调节其细胞的杀伤活性具有重要意义,对于指导NK和T细胞在免疫治疗中的应用提供参考。更多还原