东方蜜蜂微孢子虫N6-腺苷特异性甲基化转移酶基因的克隆、分子特性及表达模式

【作者】 张佳欣； 陈大福； 郭睿；

【机构】 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)；

【摘要】 东方蜜蜂微孢子虫Nosme ceranae专性侵染成年蜜蜂导致微孢子虫病,给养蜂生产造成很大损失。目前,东方蜜蜂微孢子虫的N6-腺苷特异性甲基化转移酶（N6-adenine-specific methyltransferase, N6AMT）基因NcN6AMT的研究仍然缺失。本研究对NcN6AMT的CDS区进行克隆,通过生物信息学预测NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并采用RT-qPCR检测NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）和中华蜜蜂（Apis cerana cerana）工蜂过程的相对表达量,以期丰富NcN6AMT的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子虫侵染过程NcN6AMT的功能及表观调控机制提供基础。结果表明,通过PCR扩增出大小约500 bp的目的片段,克隆测序结果显示其与GenBank数据库收录的预测出的NcN6AMT序列一致;NcN6AMT蛋白的分子量约为18.7 kDa,分子式为C₈₄₅H₁₃₇₄N₂₁₄O₂₄₉S₆,理论等电点为5.88,脂溶系数是119.76,不稳定系数为37.47,包含166个氨基酸和15个磷酸化位点,平均亲水系数为0.025,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核和液泡膜;NcN6AMT含1个结构域MTS,该结构域同样存在于家蚕微孢子虫Nosema bombycis CQ1和兔脑炎微孢子虫Encephalitozoon cuniculi等8个其他物种的N6AMT;在东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis ATCC 50506和蚱蜢脑炎微孢子虫Encephalitozoon romaleae SJ-2008的N6AMT中均预测到5个相同的保守基序;NcN6AMT与家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT序列一致性达到70.92%;东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT在系统进化树上聚为一支;东方蜜蜂微孢子虫接种后1-4 d,NcN6AMT在意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂中肠内均呈现先上升后下降的表达趋势。研究结果表明成功克隆到NcN6AMT基因的CDS区,明确了NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的N6AMT蛋白具有较高的保守性,NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂的第一个增殖周期（1-4 dpi）内动态表达且均呈上升-下降的表达模式。更多还原