基于人大脑类器官模型探讨环丙沙星神经毒性及其分子机制

【作者】 刘哈晓雨； 代艳萍； 卜迁； 岑小波；

【机构】 四川大学华西医院； 烟台大学； 成都华西海圻医药科技有限公司(国家成都新药安全性评价中心)；

【摘要】 目的环丙沙星(Ciprofloxacin,CPFX)是第三代喹诺酮类药物,具有广谱抗菌活性和良好的杀菌作用,作为经典抗生素药物广泛应用于临床。环丙沙星化学结构中的氟原子使得其亲脂性增加,组织渗透力增强,增强药效的同时也增加了其血脑屏障穿透性,造成神经毒性,影响胎儿神经发育。越来越多临床报道显示环丙沙星引发广泛神经系统不良反应,包括癫痫、精神错乱、重度抑郁症、焦虑、躁狂发作等,然而其产生神经毒性的分子机制尚不清楚,本研究旨在应用3D人大脑类器官模型探究环丙沙星的神经发育毒性及其分子机制。方法通过人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)定向分化大脑类器官模型,于分化第42天,对大脑类器官的皮质结构、细胞类型等进行鉴定。随后进行14天环丙沙星药物暴露。参照临床口服环丙沙星后患者脑组织药物浓度,设置空白对照组以及低、中、高剂量组(分别为:2μmol·L-1,20μmol·L-1,100μmol·L-1)。类器官经不同浓度环丙沙星暴露后,收集各组样本进行蛋白免疫印迹、免疫荧光、实时荧光定量PCR等分子生物学实验,研究其神经发育毒性及分子机制。结果 (1)与对照组相比,环丙沙星暴露组大脑类器官凋亡细胞数目显著增多,并呈现剂量依赖性;(2)与对照组相比,环丙沙星暴露组大脑类器官星形胶质细胞标记物GFAP阳性细胞数目随剂量增加而递减;(3)环丙沙星低、中剂量组神经前体细胞标志物PAX6、皮层深层标志物CTIP2阳性细胞数目占比显著增多,类器官分化出现增殖异常;(4)环丙沙星高剂量组表现出显著的线粒体毒性,包括mtDNA的累积,超氧化物歧化酶(SOD)表达升高,过氧化反应增多,线粒体应激相关基因ATF4,CHOP表达增高等等。结论本研究发现低中剂量的环丙沙星会促进神经元异常分化;而高剂量会引起神经发育过程中的线粒体毒性和细胞凋亡;此外,环丙沙星还会抑制星形胶质细胞发育。本研究提示人干细胞分化大脑类器官模型是一种优良的体外神经发育毒性研究模型,可广泛应用于药物神经发育毒性研究,弥补了传统动物模型和2D细胞模型的不足,为药物神经毒性的分子毒性机制研究提供新工具。更多还原