分离泛素化酵母双杂交系统筛选与芸薹黄化病毒RTD蛋白互作的桃蚜介体蛋白

【作者】 何梦君； 左登攀； 王颖； 李大伟； 于嘉林； 韩成贵；

【机构】 中国农业大学植物病理学系农业农村部作物有害生物监测与绿色防控重点实验室；

【摘要】 芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus,BrYV)属于黄症病毒科(Luteoviridae),马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),侵染时局限于寄主植物的韧皮部组织。该病毒是本实验室在我国分离得到的一种马铃薯卷叶属新病毒,至少存在BrYV-A、BrYV-B和BrYV-C三种基因型,主要在十字花科蔬菜上造成严重的病害。病毒编码蛋白的过程中,通过通读ORF3-ORF5衣壳蛋白(CP)基因的终止密码子产生通读蛋白RTP (RTP),由ORF5编码的通读区域则称为RTD,RTP通过CP部分组装到病毒粒子中,RTD从病毒粒子表面伸出,与蚜虫传毒密切相关。BrYV由蚜虫以持久非增殖方式传播,介体传播是BrYV在寄主之间扩散的主要途径。到目前为止,国内外尚无有关于BrYV在介体传毒机制方面的研究报道,RTD与蚜虫蛋白的互作关系也不清楚。因此通过分裂泛素酵母双杂交系统筛选桃蚜体内与RTD互作的介体蛋白,进一步探究二者互作的生物学意义,为芸薹黄化病毒的防控提供参考依据。首先提取了携带BrYV和健康桃蚜的RNA,质量分析合格后送往上海海科生物技术有限公司进行文库构建,采用DUALmembrane膜蛋白酵母双杂交系统构建文库,利用同源重组的方法将桃蚜cDNA重组至膜蛋白酵母双杂交文库载体(pPR3-N)。TMHMM网站预测发现BrYV-RTD蛋白无跨膜区,因此将RTD构建到膜蛋白酵母双杂交的诱饵载体pDHB1上,经过自激活检测及功能验证,选择合适的3-AT浓度用于后续筛选实验。然后将含诱饵克隆pDHB1-RTD的酵母菌株NMY51制作成酵母感受态细胞,并将桃蚜cDNA库质粒转化于感受态细胞中,转化物分别涂布于二缺(-Leu/-Trp)及四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)上30℃倒置培养3～5 d,计算诱饵蛋白与文库转化效率及挑取四缺培养基上生长的酵母单菌落,画线于加有X-Gal的四缺板,筛选与RTD蛋白互作的桃蚜介体蛋白。蓝白斑筛选后,提取酵母阳性克隆DNA并通过NCBI进行测序结果的序列比对,目前共筛选到与BrYV-RTD互作的桃蚜候选蛋白51个,这些介体因子主要与蛋白氧化还原反应相关。接下来需要对上述候选互作蛋白进行进一步的深入验证,并分析其在蚜虫传播病毒过程中的作用。更多还原