早期游泳对shank3基因敲除大鼠学习记忆的影响及机制研究

【作者】 徐丹； 赵宇； 张伟南； 孟昀晨； 孟文书； 任炳瑞； 张小燕； 卢慧慧； 闫世蕃； 甄志平；

【机构】 北京师范大学； 上海市嘉定区普通小学； 山西师范大学；

【摘要】 研究目的:本研究以早期游泳作为干预方式,通过探讨早期游泳对Shank3基因敲除大鼠海马结构(体积、海马神经元复杂性、树突棘密度)的影响,证实海马结构可塑性在早期游泳改善Shank3基因敲除大鼠学习记忆中的重要作用,并从结构蛋白、受体及分子通路蛋白解释早期游泳改善学习记忆的机制。为早期游泳缓解和改善孤独症等与Shank3基因相关的神经发育障碍性疾病的诊断、治疗及运动干预手段提供实验参考。研究方法:(1)实验动物与分组:对SD大鼠采用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建受精卵Shank3基因11-21区段外显子敲除模型。Shank3基因敲除杂合子大鼠进行繁育,采用PCR技术取子代幼鼠鼠尾进行基因型鉴定。杂合子父母繁育的纯合子KO及WT雄性大鼠作为实验用鼠。分为野生对照组(WC)、野生游泳组(WS)、Shank3基因敲除对照组(KC)、Shank3基因敲除游泳组(KS)4组。(2)早期游泳干预方案:幼鼠从出生8天起进行为期8周的早期自重游泳训练。前2周进行适应性自重训练,每周5次,训练时间由2min/次逐渐递增至40min/次。第3周开始,幼鼠以5次/周,40min/次,自重进行游泳训练持续至8周。训练时间固定在每周周一至周五下午,周六、日休息。(3)行为学评价:采用三箱实验、自梳理实验分别进行社交行为和刻板行为两项核心行为评价;采用转棒、错步、平衡木、最大抓力、跑台分别进行协调能力、平衡能力、肌肉力量、耐力水平等运动能力的评价;采用水迷宫、新异物体识别进行学习记忆能力的评价。(4)核磁影像学分析:采用Bruker小动物7.0 T核磁分析Shank3基因敲除大鼠海马脑区灰质体积、白质链接及1H波谱情况。(5)组织形态学观察:采用高尔基染色、激光共聚焦方法观察Shank3基因敲除大鼠海马脑区的神经元复杂性及树突棘密度。(6)蛋白组学筛选:采用LC-MS/MS串联质谱分析海马蛋白变化,富集差异蛋白的生物学过程、细胞定位、分子功能及KEGG通路。(7)WB测定:采用Western Blot法检测海马脑区支架蛋白、受体蛋白及分子蛋白的表达。研究结果:(1)行为学可塑性:(1)KC与WC相比,大鼠存在3类学习记忆缺陷:社交记忆缺陷、空间学习记忆缺陷、物体记忆缺陷。表现在三箱第二阶段KC大鼠不能识别新旧鼠(P>0.05);水迷宫学习时间显著延长(P<0.05);隐藏平台测试时,KC穿过平台次数显著少于WC(P<0.05),到达平台潜伏期显著多于WC组(P<0.05);新异物体识别中,KC大鼠不能对新旧物体进行区分,其对新旧物体的探索时间不存在显著差异(P>0.05)。同时亦出现刻板行为障碍,喷水自梳理行为中,KC与WC相比,自梳理行为显著增多(P<0.05)。(2)早期游泳干预后,KS与KC相比,大鼠学习记忆缺陷主要呈现如下3方面改善:水迷宫测试中,学习寻找平台时间显著减少(P<0.05),隐藏平台测试时,KS穿过平台次数显著多于KC(P<0.05),到达平台潜伏期显著少于KC组(P<0.05);新异物体识别中,大鼠在新物体上花费时间显著增多(P<0.05);但三箱第二阶段社交记忆两组无显著差异。同时刻板行为亦出现改善,喷水自梳理行为中,KS与KC相比,自梳理行为显著减少(P<0.05)。(2)组织形态学观察表明,KC组与WC组相比,海马神经元的分支数量、总分枝长度、随圆心向外围同心圆的交点数及树突棘密度均显著减少(P<0.05)。KS与KC组相比,海马神经元的分支数量、总分枝长度、随圆心向外围同心圆的交点数及树突棘密度均显著增加(P<0.05)。各组中树突棘密度与水迷宫穿过次数均有较大相关性。(3)蛋白-通路可塑性:蛋白组学共筛选1826个可信蛋白,KC与WC相比差异蛋白有37个,其中28个蛋白上调、9个蛋白下调,这些蛋白主要富集于胞吞作用、神经活性配体-受体相互作用等。研究结论:(1)早期游泳干预可改善Shank3基因敲除大鼠的学习记忆行为,体现了早期游泳提高Shank3基因敲除大鼠的行为可塑性。(2)早期游泳干预增加了Shank3基因敲除大鼠海马神经元复杂程度和树突棘密度,体现了早期游泳提高Shank3基因敲除大鼠的结构可塑性。(3)早期游泳干预改变Shank3基因敲除大鼠包括突触生长发育、突触信号传递等主要的生物学过程及RAS-ERK-CREB分子通路。更多还原