LncRPAR通过RPL5-MDM2-P53通路促进胶质瘤进展的机制研究

【作者】 辛涛； 刘倩； 高佳佳； 殷宪勇； 韩敏；

【机构】 山东第一医科大学第一附属医院神经外科； 山东大学基础医学院； 山东大学；

【摘要】 目的筛选与胶质瘤发生发展密切相关的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA),探讨胶质瘤组织中lncRNA促进胶质瘤进展的具体机制,为胶质瘤的治疗提供新的思路与依据。方法通过胶质瘤组织芯片筛选出差异表达lncRNA,在胶质瘤细胞系中利用细胞划痕实验、CCK-8实验、transwell实验、流式细胞术验证其体外生物学功能,并利用裸鼠荷瘤实验验证其体内功能。具体探究lncRNA影响胶质瘤进展机制,利用RNA pulldown结合Mass Spec技术筛选下游结合蛋白,联合应用western blot、qRT-PCR、免疫荧光、Co-IP、核浆分离等实验验证下游通路具体机制,形成完整的lncRNA-下游蛋白作用通路。结果通过胶质瘤组织芯片分析发现lncRPAR在脑胶质瘤组织中表达量明显高于正常脑组织。在U251和U87细胞系中利用质粒过表达lncRPAR后,细胞增殖、迁移、侵袭明显增加,细胞凋亡明显降低,裸鼠体内瘤体增长加快。进一步探索lncRPAR在胶质瘤发生发展中的机制,利用RNA pulldown结合Mass Spec技术检测了与其结合的蛋白质,发现RPL5和PSMB2(蛋白酶体β2亚基)可与lncRPAR结合,RNA正反pulldown也验证了这一现象,lncRPAR可作为分子支架促进两者的结合导致RPL5降解。众多研究表明RPL5可通过结合MDM2影响P53通路,免疫荧光定位到RPL5主要存在于胞浆中,而MDM2和P53主要存在于胞核中,Co-IP证实RPL5和MDM2、MDM2和P53相互结合。通过质粒过表达lncRPAR后,RPL5和P53蛋白水平明显降低而mRNA水平不变,P53蛋白泛素化水平明显升高,MDM2蛋白在胞浆中降低而在胞核中升高。结论 lncRPAR在人胶质瘤组织中高表达并通过促进RPL5和PSMB2结合加速其降解,而RPL5降解导致未结合的MDM2进入胞核中促进P53泛素化降解,最终导致胶质瘤的恶性进展。这一机制的阐明为胶质瘤的治疗提供了新的依据,lncRPAR有望成为新的治疗靶点弥补胶质瘤治疗中的不足。更多还原