miRNA-338-3p/Evi1靶向调控Smad3在白血病细胞分化中的作用机制研究

【作者】 王朝喆； 齐福； 王希娣； 孙瑞婧； 孙王男； 都鹏超； 姜国胜；

【机构】 滨州医学院； 济南市章丘区人民医院；

【摘要】 目的:探讨miRNA-338-3p/Evi1/Smad3信号轴的表达变化及其在白血病细胞定向分化中的作用。方法:CCK8实验测定K562细胞的药物增殖水平,RT-PCR测定待测基因的表达水平,Western blotting实验检测蛋白表达水平,瑞士-吉姆萨染色观察细胞形态学变化,FCM检测细胞周期和分化抗原的变化,高通量芯片测定miRNAs,TargetScan等软件预测靶基因的上游miRNAs,Luciferase实验检测miRNA对靶基因的活性调控作用,细胞转染实验检测miRNA mimics或siRNA干扰下游基因和蛋白表达变化。结果:实验结果表明1ng/ml的PMA可明显抑制K562细胞的增殖水平,并在候选浓度作用下呈现出时间依赖性,以72小时抑制作用最明显。药物诱导后细胞分化抗原CD11b和CD14表达升高,呈现出向较成熟的单核巨噬样细胞分化。PMA诱导K562细胞分化后,Evi1基因或蛋白表达水平降低,Smad3基因或蛋白表达水平升高。通过高通量基因芯片检测、靶基因预测和q-PCR验证,证实miRNA-338-3p是最有可能靶向结合和调控Evi1基因的候选miRNA。miRNA-338-3p mimics可明显降低Evi1基因表达水平,伴随Evi1下游Smad3的表达水平升高。而miRNA-338-3p inhibitor则明显升高Evi1基因的表达水平,伴随下游Smad3表达的抑制。Evi1干扰实验表明其表达被干扰后,Smad3的基因表达水平或蛋白表达水平明显升高。在功能学研究方面,与NC比较,转染3天后miRNA-338-3p mimic可明显抑制K562细胞的增殖水平,而miRNA-338-3p inhibitor组的增殖水平则与NC组没有明显差别,产生了明显的抑制逆转作用。Smad3表达升高伴随白血病细胞的单核/巨噬细胞定向分化,可能与Evi1解除对Smad3干扰而调控TGFβ/Smad通路有关。结论:miRNA-338-3p/Evi1/Smad3是调控白血病细胞定向分化为单核/巨噬细胞的新型信号通路,为发掘白血病分化生物标志物和进行靶向干预提供了重要理论基础。更多还原