【作者】 练鸿振；

【Author】 Hong-zhen Lian;State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science, School of Chemistry &Chemical Engineering and Center of Materials Analysis, Nanjing University;

【机构】 生命分析化学国家重点实验室,南京大学化学化工学院,南京大学现代分析中心；

【摘要】 核酸的大尺寸以及超常的形态易变性使其分离面临着极大的挑战。高效液相色谱(HPLC)由于分离度高、循环时间短、全部自动化等特点成为人们常用的分离技术,在核酸分离分析中广泛应用。核酸分子的结构特征能够体现在色谱行为方面,反之,色谱行为也可以揭示相关的结构信息。我们采用反相液相色谱(RPLC)为主要分析手段,考察碱基组成、序列、二级结构、色谱固定相、流动相等对核酸保留的影响,探索核酸结构—保留行为关系,探讨核酸分子与RPLC固定相之间的作用机理,研究核酸在溶液中的存在状态和结构行为。(1)寡核苷酸的保留同时受到碱基组成和碱基序列的影响,而非单纯的尺寸控制。倾向于形成自身二聚体的寡核苷酸的保留比相同碱基组成不易形成自身二聚体的寡核苷酸保留弱。对于双链DNA,保留不仅与尺寸相关,也与碱基组成和碱基序列相关。值得注意的是,核酸立体结构造成的空间位阻也是影响核酸IP-RPLC保留行为的因素之一。(2)在整体柱上,发卡结构寡核苷酸的保留均比相应线性结构寡核苷酸的保留弱。然而,在填充柱上,两者之间的出峰顺序却无规律可循。由于整体柱特殊的孔结构及其分布特点,寡核苷酸可以保持其自然状态下的构型顺利通过整体柱,保留规律易于归纳。而在填充柱中,由于固定相填料颗粒之间的通道狭窄、曲折,寡核苷酸分子通过时构型受到抑制甚至改变,导致保留行为更加复杂,保留规律难以总结。(3)在相同的离子对试剂浓度下,寡核苷酸在TEA/PA-AA体系下的保留均弱于TEAA体系下的保留,且寡核苷酸的保留均随离子对试剂浓度的增加而增强。两种体系下寡核苷酸的保留机理均以离子对模型占主导地位。(4)将IP-RPLC法LSS模型中得到的logkw/S参数称为色谱疏水-静电作用指数(CHEI),CHEI和tg之间存在很好的线性。随后,使用支持向量回归(SVR)方法建立了一种方便的根据核酸序列信息预测CHEI的模型。(5)采用RPLC、液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术结合荧光光谱、圆二色谱以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对三种不同序列d[(G3T)3G3]、d[(G3C)3G3]和d[(G3T)4]在不同退火溶液下的G-四链体多态性进行了考察。三种序列的G-四链体形态均可使用RPLC进行有效分离,使用LC-MS进行在线结构表征。RPLC、LC-MS结合光谱技术可以作为快速分离并鉴别溶液中G-四链体的一种温和、有力的工具,可有效用于评估DNA序列和退火环境对G-四链体多态性的影响。建立的分析方法为G-四链体多态性的评估提供了一种新策略。更多还原