基于代谢流和代谢物组的发酵过程优化策略

【作者】 储炬； 田锡炜； 鲁洪中； 庄英萍；

【机构】 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室；

【摘要】 细胞本身是一个受到多尺度、多通路严格调控的网络系统,因此对于特定途径的局部改造效果会在很大程度上受到限制。过去的几十年中,随着各种高通量检测技术的广泛应用,不同层次组学数据的大量获得以及生物信息学方法的逐步完善,极大地促进了系统生物学的发展。通过系统生物学的方法,在整体理解细胞生命活动规律的基础上对其进行改造是未来代谢工程的前进方向,但是目前的系统生物技术还远未成熟,工作更多集中于组合差异组学的研究。相比于基因组学、转绿组学和蛋白组学,代谢组学和通量组学可以看作是组学研究的终点,其最接近于表型,可以有效地指示基因或者环境的扰动,而且代谢物浓度和代谢流通量的变化较之DNA、RNA和蛋白质来得更为敏感,从而也更容易被发现。因此,我们将通过两个案例来说明代谢流和代谢物组在细菌和真菌发酵过程优化中的指导作用,以期有助于后续开展系统生物技术在工业微生物中应用的研究工作。案例1:代谢轮廓和代谢通量分析揭示Lactobacillus paracasei生产乳酸过程中氧代谢调节作用随着全球化石资源的不断枯竭以及环境问题的日益加剧,聚乳酸产品作为传统塑料的替代品极大地促进了全球的乳酸市场。工业乳酸生产主要通过兼性厌氧的乳酸菌发酵获得。因此控制合适的供氧水平对实现高效乳酸发酵至关重要。在本研究中,我们引入了生物参数氧摄取速率（OUR）作为微耗氧乳酸发酵的氧代谢表征参数,并考察了不同OUR水平下菌体生理和代谢特性的变化,并结合胞内代谢轮廓、代谢通量以及生化参数的分析发现在细胞生长期,高OUR水平下,细胞通过将丙酮酸代谢从乳酸合成迁移至高产ATP的乙酸合成,从而满足细胞快速生长所需的能量需求,促进细胞生长和葡萄糖代谢。当细胞进入稳定期后,高OUR水平会加剧胞内ROS水平的积累,从而抑制糖酵解途径中的关键酶（3-磷酸甘油醛脱氢酶）,导致葡萄糖消耗速率的显著下降。而且此时丙酮酸代谢更倾向于合成副产物乙偶姻,而不是乙酸。除此之外,我们还发现在L.paracasei中,对于胞内辅因子（NADH和NAD⁺）平衡的调节与细胞所处的生长状态有关,生长期细胞更多依赖于乙酰辅酶A节点（乙酸和乙醇）,而稳定期则更多作用于乙偶姻节点（乙偶姻和2,3-丁二醇）。基于上述对氧代谢调控作用的分析,我们在后续发酵过程中采用两阶段OUR控制策略,即在生长期控制合适的高OUR,而在稳定期控制低OUR水平,实现了不降低乳酸转化率的前提下,乳酸产率提高12.7%,副产物乙偶姻含量降低10.6%。案例2:基于13C标记的定量代谢物组学和代谢流整合分析在黑曲霉产糖化酶发酵过程中的应用随着全球酶制剂市场的不断扩大,黑曲霉作为一种最常见的丝状真菌,广泛的应用于各种工业酶的生产,但是对于高产酶菌株的代谢调控机理的认识仍非常有限。本研究以高产酶菌株和野生菌株为研究对象,发现高产菌株在生理代谢特性上表现出细胞生长、葡萄糖代谢和糖化酶生产的加快,而且副产物草酸和柠檬酸的含量下降。针对这些表型差异,通过代谢组学和13C代谢流分析的方法对两个菌株胞内代谢差异和调控机理进行系统研究,表明高产菌株氧化性的戊糖磷酸（PP）途径通量显著增加而三羧酸循环（TCA）的通量则明显减小。同时,高产菌株中胞内ATP/AMP的比例更高,也从侧面证实了此时PP途径通量高的原因可能为胞内高ATP含量会抑制磷酸葡萄糖异构酶（糖酵解途径关键酶）的活性。此外,值得注意的是,在野生菌株中由于细胞自身辅因子调节的不平衡使得细胞处于更高的氧化还原状态（高NADN/NAD+和NADPH/NADP+比例）,这也会最终表现在胞内草酸和柠檬酸的分泌以及胞内草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸的积累上。总而言之,通过¹³C代谢流分析和代谢组学的研究明确指出了两个菌株在生理和代谢上的差异,从而为证实代谢调控机理提供了坚实的基础。虽然通过各层次组学的组合研究已经取得很大的进展,而且在工业生物技术上的应用也日趋成熟,但是应用系统生物技术进行代谢工程或者过程工程的道路仍然任重而道远。相信在当前大数据时代下对各组学及多学科之间跨时空尺度的相关性分析有助于更加精确地认识和预测细胞的表型。更多还原