小麦叶锈菌与小麦互作中的效应蛋白筛选及功能验证

【作者】 张瑞丰； 崔立平； 范学锋； 张悦； 杨文香； 刘大群；

【机构】 河北农业大学植物病理学系河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心国家北方山区农业工程技术研究中心； 中国农业科学院；

【摘要】 由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病,是世界重要的一种真菌病害,造成了我国严重的经济损失。大量的实践证明,控制小麦叶锈菌最经济环保的方法是选育和利用抗病品种,然而叶锈菌毒性变异频繁,新的毒性小种的不断出现,往往使得抗叶锈病丧失,因此研究小麦叶锈病的致病机理对防控小麦叶锈病显得尤为重要。本试验使用小麦叶锈菌致病类型为THTT的生理小种与TcLr19非亲和互作(6h、12h、和24h、记作RIQ)与TcLr19感病突变体M433-3-11-2亲和互作早期(6h、12h和24h,记作MIQ)及各自互作6d (记作RI6d与MI6d)转录组的测序数据分析及锈菌侵染小麦期间效应蛋白的功能验证。为揭示叶锈菌的萌发过程及叶锈菌侵染小麦的机理奠定基础。利用生物信息学方法在整个RNA测序数据库中筛选效应蛋白,共筛选出2816个候选的效应蛋白。其中126个属于孢子萌发阶段与休眠夏孢子时期的显著差异基因;431个属于亲和互作时期与萌发时期的差异表达基因;279个属于互作6d与互作早期的显著差异基因。根据表达时期、表达量及基因功能注释选出13个候选效应蛋白,利用异源表达系统分析候选效应蛋白毒性。将13个候选效应蛋白与大鼠促凋亡蛋白(BAX)基因共同注射烟草发现有12个基因能在烟草上抑制BAX诱导的程序性细胞坏死(PCD),证明12个候选效应蛋白具有毒性。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)在抗叶锈近等基因系TcLr14b、TcLr16、TcLr2b和TcLr3ka上沉默基因Cluster-19789.84114、Cluster-19789.21637和Cluster-19789.98252,结果发现沉默Cluster-19789.84114后TcLr14b和TcLr3ka上锈菌的表现型均由"4"转变为"1";沉默Cluster-19789.21637后TcLr2b和TcLr14b上锈菌的表现型由"4"转变为"1";沉默Cluster-19789.98252后TcLr16和TcLr14b上锈菌的表现型由"4"转变为"1"。HIGS实验表明三个效应蛋白在锈菌的侵染寄主过程中起到毒性作用。选择沉默效果较好的两个效应蛋白Cluster-19789.84114和Cluster-19789.98252 (去信号肽)进行亚细胞定位观察。发现两个基因均定位在细胞膜和细胞核,推测两个效应蛋白被叶锈菌分泌至寄主细胞,在寄主细胞膜和细胞核发挥作用。更多还原