低氧条件下类泛素化新蛋白底物的研究和发现

【作者】 刘毅； 张旭霞； 姚丛； 李传友；

【机构】 北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病重点实验室细菌免疫室；

【摘要】 目的对比分析低氧条件下分枝杆菌中类泛素化(pupylation)的新蛋白,研究类泛素化-蛋白酶体系统(pup-proteasome system,PPS)在低氧应激条件下的调控机制。方法采用同源片段重组方法构建带his和strep双标签的pMV261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和PCR验证,导入耻垢分枝杆菌(M.sm)中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株,用免疫印迹法(western blot)验证标签蛋白和Pup蛋白在M.sm中的表达;正常和低氧培养条件下富集菌株,超声破碎离心收集上清,通过Ni+柱和strep柱纯化分离类泛素化,通过线性离子肼质谱方法对缺氧条件和正常条件下的Pup化蛋白进行差异分析。结果经PCR鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体pMV261-his6-strep Pup,并导入目的菌株,Western blot结果表明his和strep标签蛋白在M.sm中正确表达;分离纯化后的类泛素化靶蛋白浓度降低为5μg/ml,质谱分析后发现在低氧培养时磷酸吡多醛合成酶(PLPS)和胰腺同源框合成酶(PDX1)被类泛素化。结论经过双标签分离纯化后的类泛素化靶蛋白浓度降低但纯度更高,通过质谱分析在低氧条件可发现新的类泛素化靶蛋白,该研究对结核分枝杆菌的持留和潜伏感染机制有重要提示,为后续对PPS系统功能的深入研究奠定基础。更多还原