兔豆状囊尾蚴致病机制及其重组亚单位疫苗的研究

【作者】 孙晓林； 韩进欢； 苟惠天； 张小宇； 张倩； 尚清炎； 范希萍；

【机构】 甘肃农业大学动物医学院；

【摘要】 为了解豆状囊尾蚴的致病机制,明确重组蛋白pGEX-TPO18的免疫保护效果。采用SDS-PAGE从豆状带绦虫不同发育阶段的虫体中分离出4～8条主要蛋白区带,分子质量为30.4～14.9 ku。取人工感染豆状带绦虫犬自然排出的孕卵节片,虫卵计数后以不同数量虫卵感染家兔,定期采血,用间接ELISA检测家兔的抗体变化情况。结果显示,家兔自感染后第2周抗体水平开始升高,第7周开始逐渐下降。以第7周感染家兔血清对13种虫体抗原进行的Western-blot分析显示,13种虫体抗原在59.4 ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别。说明59.4 ku蛋白可成为预防兔豆状囊尾蚴病的候选抗原。提取豆状带绦虫六钩蚴RNA,根据带科其他种属绦虫18 kD基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR扩增,产物克隆于pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的PCR产物和质粒pGEX-4T-1分别用Eco RⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过PCR方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为pGEX-TPO18。用IPTG诱导表达重组质粒,收集菌体进行SDS-PAGE分析,用GST琼脂糖树脂纯化TPO18蛋白,进行Western blottting检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔,每次50μg/只,共免疫3次,末次免疫后34 d每只家兔感染1500个虫卵,感染58 d后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔7 d采血分离血清,ELISA法检测血清抗体水平,以40μg·mL^-1重组蛋白包被酶标板,血清1﹕200稀释,检测血清样品的OD492nm值。结果表明,TPO18基因的RT-PCR扩增产物为339 bp,与预期大小相符;测序结果表明无碱基突变,重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为38.6 kD的可溶性蛋白,Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带,表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测,免疫后7 d免疫组家兔抗体水平开始升高,第43 d达到峰值。经口感染虫卵后,免疫组抗体水平开始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为79.13%、65.66%和50.43%。上述结果为研制抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗奠定了基础。实验组家兔经口感染豆状囊尾蚴,对照组为健康家兔,持续观察50 d,感染后3 h、3 d、10 d、20 d、30 d、40 d、45 d、50 d采集对照组和实验组兔血清,用ELISA法检测兔血清中的IFN-γ、IL-10的动态变化。结果表明,实验组2种细胞因子水平始终高于对照组,其中Th1细胞因子IFN-γ水平在感染后35 d达到峰值,感染40 d后缓慢降低;Th2细胞因子IL-10维持在较低水平,40 d明显上升并达到峰值,45 d后缓慢降低。提示Th1细胞介导的细胞免疫与Th2细胞介导的体液免疫共同介入了宿主抗豆状囊尾蚴免疫;感染早期主要以Th1类细胞介导的细胞免疫为主,感染中期和晚期转化为以Th2细胞介导的体液免疫为主。分别在人工感染家兔后35 d、60d采取其心、肝、脾、肾、肺等脏器,经固定,制作石蜡切片,HE染色后观察。结果显示,感染35d家兔的肝脏出现空泡变性和颗粒变性;部分肺泡扩张;肾小管颗粒变性。感染60d家兔主要表现为慢性间质性肝炎、慢性肾炎、慢性肺泡气肿;心肌纤维萎缩、断裂;脾脏白髓增多等。特征性病理变化为肝脏出现六钩蚴移行所致的出血、坏死及形成大小不等的肉芽肿。研究结果阐明了在感染不同时期家兔心、肝、脾、肾、肺的一般性病理变化及肝脏的特征性病理变化,为进一步探讨其发生机制奠定基础。更多还原