Id4通过CK18抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖和侵袭转移

【作者】 陈慧菁； 于悦； 孙艳霞； 叶韵斌；

【机构】 福建医科大学附属福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室； 福建省肿瘤转化医学重点实验室；

【摘要】 目的:研究分化抑制因子4(Inhibitor of differentiation 4,Id4)对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭转移相关能力的影响,并探讨可能的作用机制。方法:采用Western blot法检测结直肠癌细胞和肠癌组织中Id4的蛋白的表达情况。以慢病毒为载体将Id4基因导入结肠癌细胞株HCT116,获得过表达Id4的HCT116细胞株HCT116-Id4。通过WST检测法、实时细胞分析仪检测(RTCA)、克隆形成实验及FACS细胞周期分析检测细胞增殖能力变化,同时通过裸鼠体内成瘤实验验证上述细胞的成瘤能力。进一步应用划痕试验和transwell迁移及侵袭实验检测细胞侵袭转移能力的改变,并采用Western blot法检测增殖相关蛋白、转移相关蛋白、EMT标志蛋白及PI3K通路蛋白表达的改变。应用免疫共沉淀(Co-IP)与质谱分析技术检测并鉴定与Id4相互作用蛋白,分析Id4与cytokeratin18(CK18)相互作用。结果:Id4在四种结直肠癌细胞HCT116、SW480、SW620和HCT-8中均呈不表达或低表达状态,而在正常肠上皮细胞中正常表达,在人结直肠癌组织中表达较癌旁组织明显降低。过表达Id4后HCT116细胞增殖及克隆形成能力均受到抑制(p<0.05),同时细胞周期阻滞在G0/G1期(p<0.05);裸鼠体内成瘤实验显示HCT116-Id4形成的瘤体体积和重量较对照组HCT116-con细胞明显减少。Western blot分析显示增殖相关蛋白survivin、PCNA及周期相关蛋白bcl-2、cyclinD1、cyclinE表达下调,p21、p27表达上调,而PI3K/AKT通路中的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT表达下调(p<0.05)。Id4过表达的HCT116细胞划痕愈合能力及transwell迁移和侵袭能力都降低,并且侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9表达下降,MMP7表达上升(p<0.05),EMT相关标志E-cadherin表达增加。进一步通过Co-IP检测及质谱等技术鉴定,发现Id4可以与角蛋白CK18在体内相互作用,并下调细胞内CK18表达,在HCT116-Id4细胞内瞬时转染质粒pCK18后MMP2, MMP9, P-ERK, P-AKT的表达上升,MMP7和E-cadherin的表达下降均回复到接近对照组HCT116-con的表达水平。结论::Id4通过与角蛋白CK18结合,下调肠癌细胞中CK18的表达水平,抑制了P-AKT信号通路及EMT,从而抑制结直肠癌细胞的生长及侵袭转移。更多还原