水稻染色体结构维持蛋白SMC1及SMC3在DSB修复中的功能研究

【作者】 刘康伟； 张建祥； 张沁梅； 冯正超； 李文龙； 杨子豪； 张超； 于恒秀；

【机构】 扬州大学；

【摘要】 DNA作为最主要的遗传物质,其稳定性是维持物种稳定、使物种不断繁衍与发展的必要条件。但在生物体生长发育过程中,外源的电离辐射、化学试剂、细胞的有毒代谢物以及内源性因素均可以导致不同形式的DNA损伤,DNA双链断裂(double-strand break,DSB)就是其中的一种。DSB是一种危害性很高的损伤形式,其正确的修复是细胞存活以及基因组稳定性的基础。真核生物细胞主要有两种DSB修复机制:非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。SMC(structure maintenance of chromosome)蛋白是一类染色体结构够维持蛋白。真核生物中有6种SMC同源蛋白:SMC1-6。SMC蛋白主要是以复合体的形式发挥功能。6种SMC蛋白两两形成异二聚体(SMC1与SMC3,SMC2与SMC4,SMC5与SMC6),再分别结合其他非SMC蛋白成分形成三种SMC蛋白复合体(凝聚蛋白、黏结蛋白和SMC5-SMC6复合体)。在酵母以及拟南芥中的研究表明,SMC1和SMC3蛋白参与DSB的修复,但是具体作用机制还需进一步研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术获取了水稻smc1、smc3-2、smc3-3突变材料,通过博来霉素和丝裂霉素敏感性分析、定量PCR分析、蛋白免疫荧光实验、体细胞重组修复率分析等方法,对SMC1和SMC3在水稻DSB修复中的作用进行综合研究。结果表明SMC1和SMC3-1在水稻幼穗中的表达量最高,而SMC3-2和SMC3-3在叶片中有较高表达;smc1和smc3-3突变体相较于野生型对丝裂霉素敏感,说明水稻中可能是SMC1和SMC3-3基因对姐妹染色单体之间的黏着更重要;smc1和smc3-2突变体相较于野生型对博来霉素敏感,表明SMC1和SMC3-2能够参与DSB修复;γ射线照射以及博来霉素处理后,smc1、smc3-2和smc3-3突变体中HR和NHEJ修复路径中相关基因的表达量相较于野生型有显著变化,表明SMC1和SMC3可以通过HR或NHEJ路径影响DSB的修复;根尖蛋白免疫结果发现smc3-3中RAD51A2蛋白信号的募集相较于野生型有显著减少,表明SMC3-3通过SDSA修复路径参与DSB修复;利用水稻体细胞重组修复率检测体系对各个突变体进行分析结果表明SMC1、SMC3-2和SMC3-3基因的突变会造成体细胞SSA重组修复率的降低,而只在smc3-3突变体中发现SDSA修复路径受到影响,即:SMC1和SMC3-2参与SSA重组修复过程,SMC3-3同时参与SSA和SDSA重组修复过程。也就是说,在DNA遭受损伤形成DSB时SMC蛋白能够积极的响应,通过参与不同的修复途径对损伤DNA进行修复,以维持基因组的稳定性。更多还原