苦豆子SaLDC启动子在拟南芥中的表达分析

【作者】 陆姗姗； 刘萍；

【机构】 宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室； 宁夏大学农学院；

【摘要】 苦豆子(Sophora alopecuroides L.)是豆科槐属多年生草本植物,主要分布于宁夏、新疆、甘肃、青海和内蒙古等干旱荒漠区,植株中的氧化苦参碱(Oxymatrine,OMA)(又称苦参素)和苦参碱(Matrine,MA)是2种重要的生物碱活性成分。苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)是苦豆子中OMA和MA生物合成的第一个关键酶基因,本研究在已获得SaLDC编码区的基础上,通过步移克隆得到该基因上游1260 bp的启动子片段,序列提交NCBI,获登录号KY038928。生物信息学分析发现,SaLDC转录起始位点位于起始密码子上游45 bp处的碱基A,SaLDC启动子区域中不仅包含启动子区的基本顺式元件TATA-box(-27)和CAAT-box(-82),还含有大量响应外界刺激的生物和非生物作用的顺式作用元件,如组织表达特异性元件Skn-1 motif、GCN4-motif,干旱胁迫响应元件MYBCORE,逆境防御应答元件TCRichRepeats,病原体响应元件WBOXATNPR1;茉莉酸甲酯响应元件CGTCA,光响应元件ACE、IBOXCORE、G-box、C-box、chs-CMA1(2)a等。此外,在SaLDC启动子序列中还存在大量的增强子元件GATA box,且集中分布于-119～-1027之间;在-806处有一个抑制子元件WRKY710S。将融合有GUS的SaLDC启动子序列通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,SaLDC启动子在转基因拟南芥幼苗期的不同生长阶段(2片叶片,4片叶片,6片叶片)均可检测到GUS酶活性,但表达水平随植株的生长呈下降趋势,且该启动子可有效驱动GUS在转基因拟南芥成株期的叶片和花萼中优势表达,表明SaLDC启动子在拟南芥中既有时空表达特异性同时也有组织表达特异性。由于Sa LDC启动子序列上有多个光信号响应元件,因而对带有该启动子的转基因拟南芥进行不同光照时间处理,研究发现由SaLDC启动子驱动的GUS在黑暗和光照下均能表达,但光诱导能增强GUS表达。根据SaLDC启动子的表达模式,用6%PEG模拟干旱对春化后16 d的转基因拟南芥幼苗分别胁迫0 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h,结果发现胁迫与未胁迫处理的植株都能被GUS染色;但胁迫1h～2h后植株的GUS染色明显较深,随胁迫时间的延长,染色又逐渐变浅。表明转基因拟南芥中的Sa LDC启动子在干旱胁迫初期对胁迫有较高的响应,但随胁迫时间的延长,GUS的表达强度逐渐降低。为进一步精确分析转基因拟南芥在干旱胁迫下GUS的表达差异,对GUS酶活性的定量测定表明,干旱胁迫1h～2h时,GUS酶活性显著升高(P<0.05),依次是胁迫前的1.39倍和1.21倍;随后GUS酶活性逐渐下降,胁迫4 h时GUS酶活性较胁迫前有所下降但无显著差异;胁迫到8 h时GUS酶活性降至最低(P<0.01),比胁迫前下降了1.40倍;当胁迫至24 h时GUS酶活性基本恢复至未胁迫水平。以上结果为认识苦豆子SaLDC启动子功能奠定了基础。更多还原