miR-181b靶向SMAD7调控猪卵巢颗粒细胞凋亡

【作者】 姚望； 杜星； 潘增祥； 李齐发；

【机构】 南京农业大学动物科技学院；

【摘要】 引言TGF-β信号通路在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用,是雌性生殖过程中不可或缺的。SMAD7作为抗TGF-β信号通路的抑制型SMAD基因,通过负反馈对TGF-β通路进行调控。在成年哺乳动物中,SMAD7主要在肾脏、肺以及卵巢中表达(Nakao等,1997)。免疫组化结果显示SMAD7在卵巢窦前卵泡、窦状卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中都有表达(Gao等,2013)。研究表明,促性腺激素能够显著降低小鼠卵巢颗粒细胞中SMAD7基因mRNA水平,暗示通过促性腺激素降低SMAD7的表达可以潜在促进卵母细胞的发育和黄体的形成(Gao等,2013)。在小鼠卵巢颗粒细胞中,过表达SMAD7可以促进颗粒细胞凋亡,而敲减SMAD7可以阻断TGF-β信号通路诱导的凋亡(Quezada等,2012)。但目前关于SMAD7在猪卵巢颗粒细胞中的作用和表达调控研究较少。材料与方法猪卵巢颗粒细胞(pGCs)分离自健康猪卵巢组织中直径为3-5 mm的卵泡,常规方法培养。采用转染miR-181b mimics、inhibitors过表达或抑制pGCs中miR-181b的表达。猪SMAD7过表达载体由上海捷瑞公司合成。QRT-PCR方法检测pGCs中相关基因mRNA水平,western blot方法检测SMAD7、磷酸化SMAD3蛋白水平。荧光素酶报告基因系统分析miR-181b对SMAD7基因3’-UTR的靶向作用。FACS技术检测颗粒细胞凋亡率。结果与讨论实验室前期研究发现敲减SMAD7可显著抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡(Liu et al,2014)。为了进一步分析SMAD7在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用,本文合成了猪SMAD7基因过表达载体,发现过表达SMAD7可显著增加猪卵巢颗粒细胞凋亡率和促凋亡基因BAX的表达,抑制抗凋亡基因BCL-2的表达,说明SMAD7可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。Westernblot分析发现过表达SMAD7可显著抑制猪卵巢颗粒细胞TGF-β通路关键蛋白SMAD3磷酸化水平,而敲减SMAD7可显著增加SMAD3磷酸化水平,说明在猪卵巢颗粒细胞中SMAD7可负反馈调控TGF-β通路。miRNA是一种长度约为22-25nt的小编码RNA分子,在转录后水平调控基因的表达。为了揭示卵巢颗粒细胞中SMAD7基因的表达调控,本文采用生物信息学方法对SMAD7基因的候选miRNAs进行了预测,结合猪卵泡闭锁miRNA表达谱(Lin et al,2012),发现miR-181b、miR-92a和miR-15b在卵泡闭锁过程中显著下调。荧光素酶活性分析发现miR-181b和miR-92a可显著降低猪SMAD7 3’UTR转录活性。QRT-PCR和western blot分析发现miR-181b可显著下调猪卵巢颗粒细胞中SMAD7基因mRNA和蛋白,说明SMAD7是猪卵巢颗粒细胞中miR-181b的靶基因。进一步研究发现过表达miR-181b可降低猪卵巢颗粒细胞凋亡率,而抑制miR-181b可增加颗粒细胞凋亡率。同时,SMAD7可阻止miR-181b的抗凋亡作用,说明miR-181b可通过SMAD7调控猪卵巢颗粒细胞凋亡。Westernblot发现过表达miR-181b可显著增加猪卵巢颗粒细胞中SMAD3磷酸化水平,而抑制miR-181b可下调SMAD3磷酸化水平,说明miR-181b可通过靶向SMAD7调控TGF-β通路,进而调控猪卵巢颗粒细胞凋亡。更多还原