小麦外源抗白粉病基因Pm12的快速克隆及功能进化研究

【作者】 朱姗颖； 高安礼； 计健； 刘任糠； 李淼淼； 刘志勇； 马朋涛； 何华纲；

【机构】 江苏大学食品与生物工程学院； 河南大学生命科学学院； 中国科学院遗传与发育生物学研究所； 烟台大学生命科学学院；

【摘要】 Pm12基因来源于拟斯卑尔脱山羊草,高抗所有测试的小麦白粉病菌株,在小麦抗白粉病育种中具有重要应用价值,但晚熟、低产等连锁累赘限制了Pm12的应用,同时由于外源染色体6SS与小麦6BS存在严重的交换抑制,导致传统的图位克隆难以奏效,这也是其他源于小麦外缘种属基因克隆中普遍存在的问题。为解决这一问题,本文利用簇毛麦Pm21基因附近的50个6VS分子标记对携带Pm12的6SS染色体进行鉴定,发现13个标记可以在小麦背景下追踪Pm12,表明6SS和6VS染色体之间存在良好的共线性,推测Pm12可能是Pm21的直系同源基因。利用能导致Pm21丧失抗性的重组病毒BSMV:Pm21as接种WL31 (Pm12),可导致叶片上产生肉眼可见的孢子堆,初步证实Pm21同源基因是Pm12抗性的必需基因。随后,根据Pm21等位基因设计了一对保守的引物,从WL31中获得了一个DNA片段,进而利用TAIL-PCR技术获得两侧序列,组装出一个候选基因Pm12-can,该基因全长7068 bp,编码区序列与Pm21有90.0%的一致性,也编码CC-NBS-LRR蛋白。转基因实验表明,Pm12-can转基因小麦对所测试的22个白粉菌小种都高抗,抗性级别与供体WL31完全一致,但与Pm21存在差异,从而证实Pm12-can就是Pm12基因。接下来,我们利用烟草瞬时表达比较分析了Pm12和Pm21编码的CC结构域的功能,发现PM12的CC、CC-NBS、CC-NBS-LRR (全长蛋白)都能引发细胞死亡;而PM21的CC也可以引发细胞死亡,但CC-NBS、CC-NBS-LRR都不能导致细胞死亡。免疫共沉淀实验证实,PM21的CC能与NBS、LRR互作,而PM12的CC不能与其他结构域产生互作。该结果暗示,尽管Pm12和Pm21基因序列存在一定的保守性,但两者在蛋白质水平和作用机理上存在着重要差异。本研究采用直系同源基因克隆(orthology-based cloning)策略快速获得、证实了Pm12基因,并研究了Pm12和Pm21的进化关系,将加速Pm12基因的育种利用和抗病基因进化关系的理解。同时,本文所用的直系同源基因克隆策略在发掘小麦外缘抗病新基因中具有重要价值,有望快速获得一批具有重要育种价值的抗白粉病新基因资源。更多还原