三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究

【作者】 魏思忱； 白文元； 田媛； 冯子南； 刘云燕；

【机构】 河北医科大学第二医院消化内科；

【摘要】 本研究通过体外细胞培养和分子生物学技术,检测人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中相关蛋白基因的表达,旨在探讨三羟异黄酮诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。目的:探讨三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制。方法:应用体外人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养技术,采用MTT法观察三羟异黄酮对肝癌细胞的增殖抑制作用,选择合适的实验剂量。HE染色观察凋亡细胞的形态学表现,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA Ladder。采用细胞免疫组化检测三羟异黄酮诱导人肝癌细胞凋亡过程中相关蛋白p53、Caspase-3、Survivin的表达,采用RT-PCR法检测Caspase-3、Survivin在基因水平的表达。结果:①三羟异黄酮对SMMC-7721细胞生长的影响:与培养基对照组相比,各种体积分数DMSO在24、48、72h对肝癌细胞未发现有明显抑制作用(P>0.05),可以排除溶剂对实验的影响。实验组在24h后,2.5、5、10μg·mL-1三羟异黄酮组对SMMC-7721细胞的抑制作用不明显(P>0.05),20、40μg·mL-1组的抑制作用与对照组比较差异才有显著性(P<0.05)。48、72h后5、10、20μg·mL-1浓度的三羟异黄酮对肝癌细胞均有抑制作用,且随浓度增加,抑制作用增强,呈时效和量效关系。其中5、10、20μg·mL-1三羟异黄酮作用48h后的抑制率分别为9.86%、19.13%、25.64%,并作为此实验所用浓度。②三羟异黄酮对SMMC-7721细胞凋亡的影响:20μg·mL-1三羟异黄酮作用48h和40μg·mL-1作用24h均可使肝癌细胞出现典型的凋亡表现,HE染色表现为核固缩、核碎裂、染色质浓缩、核小体形成等。凝胶电泳DNA片段分析发现20μg·mL-1三羟异黄酮作用48h和40μg·mL-1作用24h均可出现典型的梯状条带,而5、10μg·mL-1的三羟异黄酮组和对照组则未见梯状条带出现。③三羟异黄酮对SMMC-7721细胞凋亡过程中相关分子的影响:5、10、20μg·mL-1三羟异黄酮作用SMMC-7721细胞48h后,免疫组化显示促凋亡蛋白p53、Caspase-3的表达上调,表现为染色加深和阳性细胞数增加,图像分析显示与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。而凋亡抑制蛋白Survivin的表达降低,表现为阳性细胞数减少和胞浆着色变浅、胞核几乎不着色,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。RT-PCR结果显示5、10、20μg·mL-1三羟异黄酮可使Survivin mRNA表达水平下调,与对照组比较差异有显著性(0.602±0.077 vs 0.664±0.058,P<0.05,0.541±0.056、0.430±0.032 vs 0.664±0.058,P<0.001)。而Caspase-3 mRNA表达水平在各组未发现有显著变化(P>0.05)。结论:体外细胞培养研究表明,三羟异黄酮能诱导人肝癌细胞SMMC-7721的凋亡,其分子机制可能与上调促凋亡蛋白p53、Caspase-3的表达,下调抑制凋亡因子Survivin在蛋白和基因水平的表达有关,而Caspase-3在基因水平并未发现有变化,推测三羟异黄酮对Caspase-3的作用可能是在转录后水平,其蛋白表达的上调主要是细胞内原有酶原活化的结果。更多还原