基于恒温扩增技术快速检测剧毒鹅膏方法的建立和评估

【作者】 何正蜜； 罗涛； 范凤霞； 张平； 陈作红；

【机构】 湖南师范大学生命科学学院；

【摘要】 全世界90%以上的蘑菇中毒致死事件都是由鹅膏菌属檐托鹅膏组(Amanita section Phalloideae)的剧毒鹅膏(lethal amanitas)引起的,快速并准确地检测剧毒鹅膏对于中毒患者的临床诊断和治疗具有重要意义。本研究利用环介导等温扩增技术(LAMP)和超分支滚环扩增技术(HRCA),基于内转录间隔区(ITS)和鹅膏毒肽基因(AMA)为靶序列设计了LAMP引物和HRCA锁式探针(PLP),建立了10种剧毒鹅膏的特异性检测方法以及针对剧毒鹅膏的通用检测方法。LAMP法结合HNB染料需1 h的反应时间,而HRCA以SYBR Green I为染料则需2-3 h。通过对这两种恒温扩增检测方法的特异性、灵敏性进行分析,结果表明:(1)基于ITS设计的LAMP特异性引物可以有效地检测并区分檐托组中不同分支(clade)中的剧毒鹅膏(例如:位于同一分支的淡红鹅膏和绿盖鹅膏均呈阳性交叉反应),而HRCA特异探针可以有效地检测并区分10种剧毒鹅膏,说明HRCA比LAMP的特异性强;(2)基于5.8s rDNA和部分ITS2设计的LAMP通用引物和基于α-AMA基因设计的HRCA通用探针,均可以有效地检测剧毒鹅膏,并将剧毒鹅膏和非剧毒鹅膏区分开来;(3)LAMP和HRCA这两种方法的DNA分子检出限分别可达5 pg和188 fg。总之,本研究建立的剧毒鹅膏恒温扩增检测方法具有高特异性、通用性和灵敏性,不需要昂贵的设备,检测快速简单,可应用于蘑菇中毒现场,为鹅膏中毒毒源鉴定和患者治疗提供科学依据。更多还原