Stemphylium eturmiunum STE2和STE3基因调控有性发育过程及相关互作基因的研究

【作者】 王群； 王石； 刘小缦； 高素素； 张修国；

【机构】 山东农业大学；

【摘要】 丝状子囊真菌含信息素前体基因和信息素受体基因(pheromones and pheromone receptors),该类基因分别包括两个信息素前体基因(a和α)和两个信息素受体基因(STE2和STE3),其中信息素受体基因对性细胞识别、交配及交配后活动具有关键调控作用,可激活真菌异型细胞的有性生殖过程。信息素受体与信息素前体相互识别,特异性结合,诱发下游基因的表达,启动交配信号,使真菌营养生长停滞,生殖过程开启。我们是以新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)为实验材料(现保存于山东农业大学真菌及真菌资源利用研究室),主要研究内容包括根据已报道的信息素受体基因信息,结合软件分析找到新西兰匍柄霉全基因组中的信息素受体基因;并通过设计引物分别扩增获得STE2和STE3的左右侧翼序列,进而构建信息素受体基因的敲除载体;通过Overlap PCR克隆去除内含子的STE2和STE3基因,用于构建回补载体。通过建立根癌农杆菌介导的遗传转化系统,获得各自的敲除及回补转化子。将野生型菌株,敲除转化子和回补转化子同时在有利于产生有性态的条件下诱导,发现STE2敲除转化子不能形成成熟的子囊壳及子囊孢子,菌丝的生长较野生型的缓慢,菌丝无分隔,分叉增多且畸形,分生孢子基本不产生,DAPI染色显示野生型菌丝及子囊孢子细胞核分布均匀,STE2敲除转化子菌丝细胞核数量较少,分布不均;而STE3基因敲除转化子菌丝分叉增多且畸形,分生孢子产生数量显著增多,仅能形成发育不良的子囊壳及数量减少的子囊孢子,DAPI染色显示STE3敲除转化子菌丝中细胞核数量较少,均匀分散,子囊孢子中细胞核数量明显减少,分布不均。两基因的回补转化子分别带有GFP和RFP标签,用于定位和Western blot实验。介于两个单敲除突变体性状变化明显,我们将两个野生型菌丝时期、有性态时期及两个单敲除转化子分别提取RNA送样测转录组,并分析转录,结果显示:WT菌丝时期与STE2敲除转化子样本间差异表达基因总量为2513个,其中上调1724个,下调789个;WT有性态时期与STE2敲除转化子样本间差异表达基因总量为2890个,其中上调1650个,下调1240个;WT菌丝时期与STE3敲除转化子样本间差异表达基因总量为1804个,其中上调1115个,下调689个;WT有性态时期与STE3敲除转化子样本间差异表达基因总量为3369个,其中上调1657个,下调1712个;WT有性态时期与WT菌丝时期样本间差异表达基因总量为3158个,其中上调1348个,下调1810个。找到表达量变化很大的一些基因,即可能跟信息素受体基因调控有性发育相关途径可能互作的基因114个,重点想研究的基因10个:分别为2-信息素前体蛋白、糖苷水解酶家族18蛋白、糖苷水解酶家族32蛋白、糖苷水解酶家族128蛋白、漆酶、热休克蛋白42、细胞凋亡诱导因子2、多糖裂合酶家族3蛋白和两个未知蛋白,通过基因沉默和酵母双杂手段针对这些基因进行遗传学操作,争取理清信息素受体基因控制丝状子囊真菌有性生殖过程的一系列基因,试图阐明信息素受体对无性生长及有性进化影响的作用机制。新西兰匍柄霉信息素受体基因的敲除载体和回补载体的构建以及农杆菌介导的遗传转化系统的建立,为深入研究新西兰匍柄霉的其他基因打下良好基础。更多还原