邻苯二甲酸单（2-乙基）己酯对人正常甲状腺细胞自噬的影响及作用机制

【作者】 胡帅尔； 张紫虹； 杨美玲； 李文立； 黄建康； 唐娇；

【机构】 广东省疾病预防控制中心毒理所；

【摘要】 目的:邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）是最常用的增塑剂。人类可经消化道、呼吸道、静脉注射等途径摄入DEHP,进入体内的DEHP在多种酶的反应下主要通过邻苯二甲酸单（2-乙基）己酯（MEHP）来发挥作用。本研究拟探讨DEHP代谢物MEHP对人正常甲状腺细胞自噬的影响及其毒作用机制。方法:将不同浓度（100、200、400、800μmol/L）的MEHP处理人正常甲状腺细胞（Nthy-Ori3-1）24h后,应用Western Blot检测LC3Ⅰ、Ⅱ蛋白和p62蛋白表达,分析MEHP的剂量反应关系;将800μmol/LMEHP分别处理Nthy-Ori3-1细胞3、6、12、24h后,分析时间反应关系;联合自噬诱导剂EBSS处理细胞3h、自噬抑制剂氯喹30μmol/L处理细胞24h后,应用Western Blot检测LC3Ⅱ蛋白及p62蛋白的表达水平,并利用荧光显微镜观察细胞RFP-GFP-LC3荧光斑点和RFP-p62荧光斑点的变化,以分析和比较MEHP和自噬诱导剂或自噬抑制剂的异同;应用LysoSensor^TM Green DND-189测定细胞内溶酶体pH值变化,使用荧光显微镜下观察试验结果,以确定MEHP是否通过抑制溶酶体酸化而抑制自噬。结果:Western Blot结果显示随剂量和时间的增加,细胞内LC3Ⅰ、Ⅱ蛋白和p62蛋白表达增加,且联合自噬诱导剂EBSS后,Western Blot结果显示LC3Ⅱ蛋白和p62蛋白表达进一步增加;而联合自噬抑制剂氯喹后,LC3Ⅱ蛋白和p62蛋白并没有进一步增加。利用荧光显微镜观察细胞内RFP-GFP-LC3串联体,结果显示黄色点状聚集增加（自噬体增加）,红色不增加（自噬溶酶体不增加）,RFP-P62荧光斑点较对照组增加。提示MEHP通过抑制自噬小体的降解抑制Nthy-Ori3-1细胞自噬。使用LysoSensor测定细胞pH值变化,结果显示氯喹组绿色荧光斑点增多,MEHP组无明显变化,则表明MEHP对溶酶体内pH变化无影响。结论:MEHP对细胞的自噬的抑制有明显的剂量和时间效应;MEHP通过抑制自噬小体的降解抑制自噬;且MEHP与氯喹抑制溶酶体酸化从而抑制自噬的途径不同,但具体是抑制自噬体与溶酶体的融合还是抑制溶酶体蛋白酶活性有待于进一步探讨。更多还原