家蚕抗菌肽Cecropin A单克隆抗体制备及其对Cecropin A组织特异性表达检测

【作者】 胡丛武； 李瑞林； 侯成香； 高坤； 耿涛； 郭锡杰；

【机构】 江苏科技大学生物技术学院； 中国农业科学院蚕业研究所； 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所；

【摘要】 球孢白僵菌是家蚕的重要病原,危害着蚕业生产的发展,同时也是最普遍采用的生防真菌之一。目前已知抗菌肽作为家蚕先天免疫过程中一类主要的抗菌复合物,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌等具有很好的杀死或抑制生长作用。抗菌肽种类繁多,作用机制也不尽相同。通过对球孢白僵菌侵染家蚕幼虫后的转录组数据及血淋巴差异蛋白组数据进行分析,发现抗菌肽Cecropin A在家蚕受到球孢白僵菌侵染后显著上调表达,并且家蚕Cecropin A在家蚕体内体外都对白僵菌有明显的抑菌作用,但其发挥作用的具体机制还不清楚。本研究根据NCBI登录的抗菌肽BmcecropinA（登录号:NM₀01043997.1）cDNA序列,采用生物信息学抗原性分析预测软件对序列进行分析,化学合成法合成CecropinA成熟肽（23～63）以及51～63氨基酸序列,分别偶联KLH和BSA后以此为抗原混合免疫Balb/c小鼠,制备获得小鼠源单克隆抗体,获得两株可识别特异性抗原表位的杂交瘤细胞株。通过蛋白质印迹检测发现杂交瘤细胞培养上清液对家蚕Cecropin A具有明显的特异性抗原抗体反应。利用杂交瘤细胞上清以1:10比例稀释后对大造品系家蚕血淋巴进行蛋白质印迹检测,结果显示仅其中一株杂交瘤细胞上清能在PVDF膜上与抗原结合产生特异性单一条带,大小约为5kD,即为目的蛋白CecropinA,表明该细胞株产生的单克隆抗体可识别线性表位,不依赖于抗原的特定构象;继续使用该株杂交瘤上清对家蚕大造品系、箐松×皓月品系血淋巴进行蛋白质印迹检测,结果显示相同大小位置上,箐松×皓月品系并未检测到条带,表明该株杂交瘤上清所识别的抗原表位处存在氨基酸多态性,造成其对抗原的识别具有家蚕品系特异性。本研究所制备的单克隆抗体将被应用于CecropinA在家蚕幼虫感染球孢白僵菌后的组织特异性表达及其互作蛋白的筛选等研究工作。更多还原