SLC27A5缺失通过激活Keap1/Nrf2通路促进肝癌增殖的机制研究

【作者】 高庆祝； 张桂冀； 郑亚秋； 杨翼； 黄爱龙； 汪凯； 唐霓；

【机构】 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室；

【摘要】 目的研究溶质载体家族27成员5(Solute Carrier Family 27 Member 5,SLC27A5)在肝癌发生发展中的作用及其分子机制。方法利用TCGA数据分析肝癌与癌旁组织中SLC27A5表达情况及其与预后的关系,并在临床肝癌标本中进行Western Blot和免疫组化验证;利用重组腺病毒和CRISPR/Cas9系统,分别建立SLC27A5过表达和基因敲除两种细胞模型,通过MTS、EdU和克隆形成实验观察SLC27A5对肝癌细胞增殖的影响,通过裸鼠皮下成瘤和肝原位移植瘤模型观察SLC27A5对肿瘤增殖的影响;利用RNA-Seq技术分析SLC27A5调控的靶基因,q-PCR、Western Blot和IHC技术证实SLC27A5对靶基因的调控;利用抗氧化反应元件(Anti-oxidant response element, ARE)-荧光素酶活性报告系统、q-PCR和Western Blot检测Keap1/Nrf2信号通路的活化状态;利用CellROX?Orange探针,丙二醛(MDA)检测试剂盒和4-羟基壬烯酸(4-HNE)抗体分别检测细胞内活性氧(ROS)和脂质过氧化水平;利用超高效液相色谱-串联质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)测定4-HNE对Keap1蛋白半胱氨酸残基的修饰;肝癌细胞、裸鼠皮下成瘤和肝原位移植瘤模型中,观察沉默TXNRD1联合索拉菲尼处理对肝癌细胞和肿瘤增殖和凋亡能力的影响。结果 TCGA数据分析和临床肝癌组织检测发现SLC27A5在肝癌组织中显著低表达(p<0.001),其表达与肝细胞癌患者预后呈正相关(p<0.01)。过表达SLC27A5抑制PLC/PRF/5和SK-Hep1细胞增殖;敲除SLC27A5基因促进HepG2细胞增殖,裸鼠皮下成瘤模型中过表达SLC27A5抑制肝癌增殖;肝原位移植瘤模型中敲除SLC27A5促进肝癌增殖。过表达SLC27A5下调TXNRD1表达,敲除SLC27A5上调TXNRD1的表达,临床肝癌组织标本中SLC27A5 mRNA表达与TXNRD1 mRNA表达成负相关(r=-0.35,p=0.02)。过表达SLC27A5抑制ARE荧光素酶活性、Nrf2核转位和下游靶基因表达;敲除SLC27A5增加ARE荧光素酶活性、促进Nrf2核转位和下游靶基因表达。过表达SLC27A5抑制ROS产生和脂质过氧化,敲除SLC27A5促进ROS产生和脂质过氧化。UPLC-MS/MS检测4-HNE修饰Keap1蛋白半胱氨酸残基位点是Cys513和Cys518。与单用索拉非尼相比,沉默TXNRD1联合索拉菲尼明显抑制肝癌细胞和肿瘤增殖、促进肝癌细胞和肿瘤凋亡。结论 SLC27A5异常低表达,增加ROS和脂质过氧化水平,激活Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,上调TXNRD1表达,促进肝癌增殖。更多还原