全牛源单克隆抗体的制备方法及其应用

【作者】 李坤； 王省； 周莎莎； 曹轶梅； 包慧芳； 陈应理； 李冬； 李平花； 白兴文； 孙普； 付元芳； 张婧； 马雪青； 刘在新； 卢曾军；

【机构】 中国农业科学院兰州兽医研究所；

【摘要】 研究背景:牛单克隆抗体不同于其他物种的单克隆抗体分子,具有超长的互补决定区3（HCDR3）,最长至70个氨基酸,因此有利于识别深藏的表位。最近研究报道,HIV首次在牛体内诱导产生了广谱中和抗体,该广谱抗体产生与牛IgG分子的超长HCDR3相关。可以看出牛单克隆抗体在研究抗原结构方面具有独特的优势。目前,全牛源单抗生产技术至今还未见在反刍动物医学领域的应用报道。研究目的 :利用单个B细胞PCR技术制备全牛源单克隆抗体。通过筛选口蹄疫病毒（FMDV）感染牛外周血中分泌广谱中和抗体的B细胞克隆,测定抗体的编码基因序列,体外表达具有广谱病毒中和作用的单克隆抗体,为广谱疫苗毒株的培育、构象性分子疫苗抗原的研制以及新型FMDV ELISA检测方法的建立奠定基础。方法 :本研究以FMDV为模式抗原,使用三个谱系O型FMDV毒株依次免疫牛,免疫间隔一个月。在三免后7天分离PBMCs,然后以生物素（biotin）标记的O型FMDV为诱饵抗原,通过加入抗IgM-FITC、抗CD21-PE,并结合抗biotin-APC二抗染色,然后利用流式细胞仪IgM^-CD21^+/-FMDV⁺单个B细胞分选至含裂解液的96孔PCR板,进一步加入逆转录酶,最终获得cDNA模板。利用已有的牛抗体基因序列,通过同源比对分析,分别在牛IgG FR1以及恒定区设计上下游引物,然后利用巢式PCR方法,从单个B细胞中扩增出抗体可变区VH和VL基因。通过把VH和VL基因分别插入到全牛源抗体表达载体CH-pcDNA3.4和CL-pcDNA3.4,然后把携带全长重链及全长轻链的表达载体共转染CHO-S细胞,培养10天,收获上清液,利用Protein G柱子纯化全牛源单抗。最后借助间接免疫试验、ELISA和病毒中和实验来验证制备的全牛源单抗的活性。结果和结论 :本研究成功研制出一种全牛源单克隆抗体的制备方法,并获得多株具有中和不同谱系FDMV的全牛源单克隆抗体。为FMDV感染牛诱导产生广谱中和抗体提供了一种良好的方法,为研究牛的抗体免疫应答和分离治疗性抗体提供了一种新的技术手段。更多还原