绵羊CTLA-4IgV-EgG1Y162-2质粒的构建及表达

【作者】 孔慧芳； 周彦霞； 李玉娇； 张杰； 曹春宝； 周文涛； 丁剑冰； 周晓涛；

【机构】 新疆医科大学； 新疆医科大学第五附属医院中医科；

【摘要】 研究背景及目的 :棘球蚴病（Echinococcosis）是棘球绦虫寄生于人及某些动物等宿主体内所致一种严重的人畜共患病,新疆发病率每年已达42/10万,免疫预防控制仍是目前最经济、快速、有效的方法。课题组在细粒棘球蚴中发现了新基因-EgG1Y162抗原基因（专利号2009103001062）,并验证其有疫苗保护作用,进一步研究发现egG1Y162-2刺激机体产生的免疫反应和抗体水平明显高于egG1Y162-1。基于CTLA-4胞外区可与抗原提呈细胞（APC）上的B7分子高效结合特性,本课题欲将CTLA-4胞外区与egG1Y162-2进行融合,制备CTLA-4IgV-EgG1Y162-2融合蛋白,为进一步利用融合蛋白免疫小鼠,评判绵羊CTLA-4胞外区对egG1Y162-2的免疫佐剂作用创造前提,为细粒棘球蚴病重组亚单位疫苗的研制奠定基础。方法 :利用生物信息学技术确定绵羊CTLA4（NM₀01009214）的胞外区,设计引物从被ConA活化的绵羊外周血淋巴细胞中扩增CTLA-4胞外区编码序列并连入pMD19-T载体,获得质粒pMD19-T-CTLA-4IgV。将CTLA-4IgV酶切后连接入原核表达载体pET-30a（+）中,构建质粒pET30a-CTLA-4IgV。同时,从原头蚴cDNA中扩增出EgG1Y162-2基因,酶切连入pET30a-CTLA-4IgV载体,构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2。将重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2转入BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达蛋白,裂解后采用SDS-PAGE、Werstern blot检测相应蛋白表达。结果 :成功构建CTLA-4IgV-EgG1Y162-2原核表达质粒;诱导表达纯化融合蛋白CTLA-4IgV-egG1Y162-2,SDS-PAGE及Werstern blot结果均显示在38.124KD处有蛋白条带出现。结论 :成功构建CTLA-4IgV-EgG1Y162-2原核表达质粒并能正常表达相应蛋白,为后期评判绵羊CTLA-4胞外区对egG1Y162-2的免疫佐剂作用提供前提条件。制备CTLA-4IgV-egG1Y162-2重组蛋白,对疫苗进行改良与优化,为囊型包虫病的防治提供新思路、新方法、新技术。更多还原