柿炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【作者】 王洁； 高瑞； 余贤美； 艾呈祥；

【机构】 山东省果树研究所；

【摘要】 从山东、湖南、河北、浙江和广西等5省柿产区采集疑似炭疽病的柿发病枝条及叶片进行组织分离、纯化、培养,从所获得的3类菌株中选择形态学不同的代表菌株SD010、GX016和HB001进行后续试验和分析。观察记录代表菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上的菌落及分生孢子的形态特征。提取代表菌株总DNA,利用真菌通用引物分别扩增了rDNA-ITS区、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白基因(actin,ACT)和微管蛋白基因(betatubulin,TUB2)。利用DNASTAR软件进行一致率比较和分析,基于多基因序列联合,采用Mega5.1中邻位加入法(neighbor-joining,NJ)和GenBank中已有相关炭疽菌序列进行系统发育树构建。采用菌丝块枝条及叶片接种法对代表分离菌株的致病性进行测定。共分离纯化获得102个菌株,根据形态学差异将其分成3个类别(代表菌株SD010、HB001和GX016,在菌落形态及分生孢子形态上具有较大差异),其中SD010和HB001与已报道的炭疽菌属当中的哈锐炭疽菌(Colletotrichum horii)和胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)形态特征相似,GX016与博宁炭疽菌(C. boninense)形态特征相似。序列扩增结果表明,菌株SD010的ITS区、GAPDH、ACT和TUB2序列实际长度分别为:597、278、282和727bp,HB010菌株4个基因序列实际长度分别为:598、277、282和699bp,GX016菌株4个基因序列实际长度分别为:617、262、293和768bp。序列分析表明SD010的4个基因序列与C.horii模式菌株ICMP17968的相关基因序列同源性为100%;HB010的4个基因序列与C. fructicola模式菌株ICMP 18613的相关基因序列同源性为100%;GX016的ITS区域、GAPDH和ACT序列与C. karstii CBS 127591相关基因序列同源性为100%,TUB2序列与C. karstii CS26-2菌株相关基因序列的同源性为99.6%。以C. acutatum的相应序列为外组群进行多基因联合系统发育分析,3个菌株分属于两个大分支,SD010和HB010同属于胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)复合种群大分支,其中SD010与C.horii菌株聚为一簇,HB010与C. fructicola菌株聚为一簇,GX016与C. karstii聚为一个分支,属于C. boninense大分支。接种试验结果显示,三类代表菌株回接症状与田间自然发病症状较为相似,均在柿树嫩茎上有较强的致病力,GX016对柿树叶片的致病力最强,其余两个稍弱。综上,柿炭疽病可由C. fructicola、C. horii和C. karstii引起,其中C. horii在采集地区均有分布,为主要病原菌,C. fructicola和C. karstii是新发现的柿树炭疽病病原菌。更多还原