DkMATE3在柿原花青素前体跨膜转运中的偏好性研究

【作者】 刘颖； 张青林； 徐莉清； 罗正荣；

【机构】 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室；

【摘要】 柿果实存在一种特化的果肉细胞——单宁细胞,其液泡中高含量的原花青素(proanthocyanidin,PA;俗称"柿单宁")是导致涩感的主要原因。原花青素前体物质主要在细胞质内合成,而累积和聚合在液泡内,因此柿原花青素代谢涉及其前体物质的跨膜转运。已知MATE(multidrug and toxic compound extrusion)是一类跨膜转运蛋白,但其对柿原花青素前体转运的偏好性及其与果实脱涩的关系尚不明确。以‘鄂柿1号’(完全甜柿)和‘磨盘柿’(非完全甜柿)花后2.5、5、10、15、20、25和27.5周的果实,‘鄂柿1号’花后20周的花、叶、萼片、果皮、果心和种子,以及‘本氏烟草’(Nicotiana benthamiana)为材料,检测原花青素含量(Folin-Ciocalteau法);利用qRT-PCR、基因克隆和载体构建、系统进化分析和多重比对、亚细胞定位、柿活体叶片瞬时表达等技术进行相关基因功能解析;通过同源建模、定点突变、大肠杆菌体内互补试验和HPLC等进行DkMATE3跨膜转运偏好性确认。前期已建立柿相关转录组和蛋白质组数据库,并通过差异表达筛选出与柿原花青素代谢有关的MATE基因家族6个成员。在不同脱涩类型中的表达模式显示,DkMATE3在果实发育前期表达量较低,而在后期较高,可能是导致完全甜柿和非完全甜柿果实发育后期原花青素含量仍然较高的原因。通过RACE获得DkMATE3全长;跨膜结构域分析结果显示DkMATE3可以分为膜外区、膜内区以及12个跨膜结构域。系统进化树分析结果表明DkMATE3和参与类黄酮转运的MATE蛋白同属一类;序列多重比对结果表明DkMATE3与拟南芥AtDTX35氨基酸序列同源性为92%。亚细胞定位结果显示DkMATE3定位于液泡膜。DkMATE3在萼片表达量最高,其次是叶片,在果皮、果心、果肉表达量中等,在种子和花中表达量较低。利用农杆菌介导的活体叶片瞬时超表达和干涉表达结果进一步验证DkMATE3与原花青素含量变化呈正相关。应用HPLC分析瞬时转化DkMATE3后活体叶片的原花青素成分,发现在完全甜柿中DkMATE3对表儿茶素和表儿茶素没食子酸转运具有偏好性,而在非完全甜柿中则对儿茶素和表儿茶素转运具有偏好性。通过预测Dk MATE3与原花青素前体物质的结合位点并进行定点突变,证明其位于第2、7和8跨膜结构域以及膜外区的373S、374K位点。利用大肠杆菌体内互补试验进一步证明DkMATE3具有儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸的转运活性。综上所述,DkMATE3对前体物质的偏好性跨膜转运,是不同脱涩类型柿品种果实原花青素单体及其比例不同的直接原因。更多还原