miRNA858及其靶基因DkMYB19/DkMYB20参与柿原花青素代谢调控

【作者】 杨思潮； 张萌； 徐莉清； 张青林； 罗正荣；

【机构】 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室； 黄冈师范学院大别山特色资源开发湖北省协同创新中心/经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室；

【摘要】 原花青素(Proanthocyanidin)具有广泛的生物学功能和应用前景。miRNA在园艺植物中的功能已经被广泛鉴定,但其是否参与柿原花青素合成代谢调控尚未见报道。以中国甜柿‘鄂柿1号’花后10周的果肉、非完全甜柿‘恭城水柿’组培苗和拟南芥为对象,利用Folin-Ciocalteau法和DMACA染色法检测原花青素含量;进行样品RNA提取和cDNA合成,LUC酶活性检测,PCR和qRT-PCR,基因瞬时表达(柿活体叶片瞬时表达、柿果实圆片瞬时转化),拟南芥和柿组培苗遗传转化等,对已鉴定的miRNA858及其靶基因DkMYB19/DkMYB20在中国甜柿原花青素代谢中的功能进行探讨,以期解析柿原花青素代谢调控网络。通过对‘鄂柿1号’microRNA数据库和转录组数据库分析,筛选到与柿原花青素代谢相关的miRNA858,预测到2个靶基因DkMYB19和DkMYB20。LUC酶活性检测表明miRNA858对靶基因DkMYB19/DkMYB20存在负调控作用。在柿活体叶片瞬时超表达miRNA858后,DkMYB19/DkMYB20及原花青素合成相关结构基因表达量下调,叶片中原花青素含量降低;瞬时表达STTM858(抑制miRNA858表达)后,DkMYB19/DkMYB20及原花青素合成相关结构基因表达量显著上调,叶片中原花青素的含量相应上升。在柿果实圆片中瞬时转化miRNA858,通过DMACA染色显示超表达miRNA858的果实圆片染色程度较空白对照颜色浅,Folin-Ciocalteau法检测表明超表达miRNA858的果实圆片原花青素含量较对照降低;瞬时转化STTM858和DkMYB19/DkMYB20后果实圆片染色程度均较空白对照深,其圆片中原花青素含量增加。通过花序侵染法将miRNA858转化拟南芥,比较转基因型F1代和野生型种子表皮颜色,发现转基因型F1代种子颜色明显浅于野生型。通过农杆菌介导的柿组培苗叶片遗传转化技术分别获得DkMYB19和DkMYB20超表达植株各3株,DkMYB19的表达量在超表达转基因阳性株系中较对照分别上调1.34倍、0.95倍和0.75倍,原花青素合成相关基因表达量不同程度上调,且转基因株系中原花青素含量高于野生型;DkMYB20的表达量在转基因株系中较对照分别上调61.13倍、6.74倍和13.80倍,原花青素合成相关基因的表达量及原花青素含量变化类似DkMYB19转基因株系。综上所述,miRNA858通过抑制靶基因DkMYB19/DkMYB20表达从而负调控柿原花青素的合成。更多还原