樱桃小果病毒–1北京分离物全基因组序列分析

【作者】 陈玲； 李永强； 段续伟； 张晓明； 王晶； 闫国华； 周宇； 张开春；

【机构】 北京市林业果树科学研究院农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室北京市落叶果树工程技术研究中心； 北京农学院植物科学技术学院；

【摘要】 樱桃病毒病在生产中危害严重,其主要以嫁接的方式进行相互传播,导致树势衰弱,果实产量和品质下降。为此,开展病毒原种类监测分析,对于其检测体系及樱桃无毒化技术,获得无病毒原种以及病毒病防控具有重要的理论意义和应用价值。2017年6月5日从北京昌平区表现花叶的甜樱桃植株上采集叶片进行小RNA测序,根据获得的contig序列设计特异性引物,用overlapping RT-PCR和5?-、3?-RACE技术扩增获得樱桃小果病毒–1(Littlecherryvirus-1,LChV-1)北京分离物基因组全序列,命名为LChV-1-BJ。从NCBI上收集另外13个LChV-1基因组全序列,通过软件RDP v.4.95对14个全序列进行重组分析,采用MEGA6对非重组的LChV-1全序列、其基因组编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase,RdRp)、热激蛋白70 h(heat-shock protein,HSP70h)、衣壳蛋白(coat protein,CP)3个顺反子的核苷酸序列进行系统发育分析。测序发现79个contig靶向LChV-1,overlappingRT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)分析结果表明,LChV-1-BJ全长16 928 nt(GenBank accession number MK775591),包含8个可读框(open reading frame,ORF),其中1～75 nt是5?非翻译区、16 723～16 928 nt是3?非翻译区、其余区域编码8个ORF。各ORF与NCBI上收集的13个全序列编码的对应ORF在核苷酸和氨基酸水平的相似性分别为ORF1a,71.19%～98.24%和76.36%～98.47%;ORF1b,74.35%～99.22%和85.44%～99.22%;ORF2,66.67%～95.83%和58.33%～90.32%;ORF3,69.11%～98.85%和74.11%～98.37%;ORF4,72.78%～98.39%和74.08%～97.87%;ORF5,71.07%～98.68%和71.32%～97.87%;ORF6,70.04%～98.64%和68.13%～98.64%;ORF7,62.93%～98.99%和70.13%～99.13%;ORF8,70.28%～98.89%和68.62%～97.91%。在全基因组水平,LChV-1-BJ与G153分离物的相似性最低,为73.25%,与Kyoto-2分离物相似性最高,为98.51%。重组分析表明14个LChV-1分离物中存在2个重组体,对非重组序列的系统发育分析表明LCh V-1聚类在5个不同的组,与寄主和地理位置无关。其中,LChV-1-BJ与近期报道的日本分离物Kyoto-2共同聚类在新报道的第V组,与中国泰安分离物聚类在不同组。综上,LChV-1在基因组水平存在多样性,获得LChV-1的全基因组序列有助于开发针对LChV-1的检测技术,对于无病毒接穗和砧木认证具有重要意义。更多还原