杧果MinSPS1的克隆及表达载体的构建

【作者】 白蓓蓓； 荆永琳； 赵志常； 陈业渊；

【机构】 海南大学热带农林学院； 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室；

【摘要】 蔗糖代谢是影响果实风味的重要因素,在代谢过程中以二磷酸尿苷葡糖(UDP-Glc)和6–磷酸果糖(F6P)为底物,蔗糖磷酸合成酶催化生成6–磷酸蔗糖(S6P),6–磷酸蔗糖在磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)水解形成蔗糖,蔗糖在转化酶的作用下产生葡萄糖和果糖。其中蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶。目前SPS基因已在玉米、蚕豆、水稻、柑橘、甘蔗、甜菜、文心兰、甜瓜、菠菜等多种作物中均已克隆。但杧果的SPS基因未见相关研究报道,杧果属于淀粉转化型果实,果实成熟后将淀粉转化为可溶性糖,其中蔗糖的含量最高,果糖次之,葡萄糖最低。在完熟期酸性转化酶活性降低,蔗糖磷酸合成酶活性增加;蔗糖磷酸合成酶基因在蔗糖合成通路中有着举足轻重的作用,可直接影响可溶性糖的含量。本研究从杧果的果肉中克隆得到了1个MinSPS1,并对该基因进行生物信息学分析以及对该基因的功能进行研究,为杧果果肉蔗糖合成的作用机理及其该基因对果肉甜度的影响提供理论依据,因此可揭示该基因在杧果果肉蔗糖合成的分子机理。以‘贵妃杧’果肉为试材,提取果肉从青熟期到完熟期各时期的RNA;以成熟期果肉cDNA为模板,克隆MinSPS1全长,并构建pBI121-MinSPS1过表达载体;运用生物信息学对MinSPS的序列、同源性、结构域及进化树进行分析;采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的果肉中的表达量进行分析。结果显示:杧果果肉中蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)基因的cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 kD,等电点为6.08。杧果MinSPS1与柑橘(Citrus clementina)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、栓皮栎树(Quercus suber)和毛果杨(Populus trichocarpa)物种的蛋白序列比对,同源性分别为84%、81%、81%和81%,说明它们之间的亲缘关系很近。对MinSPS1编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析结果显示MinSPS在完熟期贵妃杧果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。更多还原