NUDCD1在结直肠癌中的作用及其机制研究

【作者】 韩彬； 许可； 柏杨； 周黎明；

【机构】 四川大学华西医学中心基础药理教研室；

【摘要】 目的:探讨NUDCD1对结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移过程的影响,分析NUDCD1对结直肠癌细胞周期和凋亡的生物学作用及调控机制。方法:Real-time PCR检测NUDCD1 m RNA, Western blot和IHC检测NUDCD1蛋白在结直肠癌组织标本和癌旁组织标本的差异表达,分析NUDCD1表达差异和结直肠癌患者病理特征的相关性。筛选NUDCD1异常高表达的结直肠癌细胞株,构建NUDCD1的Crisper/Cas9 cg RNA质粒和阴性对照质粒并对筛选出的细胞株进行转染。MTT比色法绘制结直肠癌细胞的生长曲线;划痕实验和transwell实验检测转染NUDCD1-cg RNA后结直肠细胞的迁移能力和侵袭能力变化,Western blot检测结直肠癌细胞转移和侵袭的相关蛋白表达变化;分别分别用PI、AnnexinV/PI、Hochest/PI荧光染料对转染NUDCD1-cg RNA后的结直肠癌细胞进行染色,流式细胞仪和荧光显微镜观测转染后的结直肠癌细胞的周期和凋亡变化,Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达变化。结果:NUDCD1在结直肠癌组织中m RNA和蛋白出现明显的表达上调,差异有显著性(P<0.05),且NUDCD1表达情况和结直肠癌duke分级,TNM分级有一定的相关性。筛选出与正常结直肠癌上皮细胞相比NUDCD1呈现明显上调趋势的结直肠癌细胞株HCT116和HT29,对这两种细胞株分别转染NUDCD1沉默质粒(NUDCD1-cg RNA)和阴性对照质粒(NC-cg RNA)后,转染NUDCD1-cg RNA细胞中的NUDCD1 m RNA和蛋白较转染NC-cg RNA的细胞明显下调,MTT比色法结果显示NUDCD1被沉默的HCT116和HT29细胞的增殖能力明显弱于阴性对照细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。NUDCD1被沉默后,划痕实验和transwell实验表明结直肠癌细胞株迁移的细胞数减少,迁移能力较阴性对照组明显下降,差异有显著性(P<0.05);含基底胶的transwell实验表明结直肠癌细胞的侵袭能力也明显减弱,差异有显著性(P<0.05);结直肠癌细胞迁移和侵袭相关的蛋白表达:vimentin明显下调,E-cadherin明显上调,N-cadherin明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。NUDCD1被沉默后,PI染色并用流式细胞仪观察结直肠癌细胞的周期变化,发现G0/G1期细胞所占比例较阴性对照组增大,而S-G2/M期细胞所占比例较阴性对照组减少,差异有显著性(P<0.05),出现细胞周期阻滞;AnnexinV/PI染色并用流式细胞仪和荧光显微镜观察结直肠癌细胞的凋亡变化情况,发现NUDCD1被沉默后,结直肠癌细胞的凋亡增多,差异有显著性(P<0.05);检测细胞周期和凋亡相关蛋白:cyclin D1表达下调,Bcl2表达下调,CleavedCaspase3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:NUDCD1在结直肠癌的增殖、侵袭、转移过程中发挥了重要作用,其作用机制方式可能是通过影响细胞迁移、侵袭、周期和凋亡相关蛋白,加快细胞增殖周期,减少细胞凋亡,增强细胞的转移和侵袭能力。更多还原