鸡肉源沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌三重定量PCR检测

【作者】 李慧芳； 宋阔阔； 姬晶晶； 杨子龙； 刘娜； 刘彦威； 刘利强； 刘建钗；

【机构】 河北工程大学生命科学与食品工程学院； 河北省禽病工程研究中心；

【摘要】 鸡肉已成为人们日常生活的重要消费品,然而鸡肉及其制品中的一系列食品安全问题制约着其健康发展,其主要的致病菌有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等。目前对致病菌的检测虽有多种方法,但都存在一些问题,因此研究建立更高特异性、高通量、定量、快速的鸡与鸡肉制品中主要致病菌的检测方法显得尤为重要,可以为本地区开展鸡与鸡肉类产品的安全性研究、防控食源性疾病的发生提供技术支持。建立一种高通量、定量、快速检测技术,而定量PCR实现了PCR技术从定性到定量的飞跃,且适合多重反应。根据Gen Bank中已发表的禽源致病性沙门氏菌,金黄色葡萄球菌和肠球菌的基因组序列,采用Primer Express5.0软件分别设计一对特异引物,沙门氏菌扩增片段279bp,金黄色葡萄球菌扩增片段395bp,肠球菌扩增片段445bp,以SYBR Green I为扩增产物荧光染色剂,建立一种具有特异性、敏感性,且能快速检测鸡肉中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌和肠球菌的三重SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行反应体系的优化、敏感性分析、特异性验证、重复性试验,并用临床组织样本对该方法的特异性进行检测。结果显示研究以临床分离的禽源沙门氏菌,金黄色葡萄球菌和肠球菌为实验株,基于三重SYBR Green I荧光染色的LC-PCR技术,能扩增出特异性的目的片段,无引物二聚体;检测3种致病菌灵敏度达101cfu/m L;重复性熔解曲线趋于一致,且三种菌的Tm值可区分。从不同鸡肉中采集样本的DNA作为模板,经普通PCR方法进行检测,结果显示沙门氏菌扩增出大小约279 bp,金黄色葡萄球菌扩增出大小约395 bp,肠球菌扩增出大小约445 bp。经3重SYBR Green I荧光定量PCR方法进行检测,特异性扩增曲线,走向一致,熔解曲线趋于一致。且CT值与菌落相对应。说明该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可用于禽源致病性沙门氏菌,金黄色葡萄球菌与肠球菌的快速和定量检测。更多还原