检测牛冠状病毒抗体的诊断方法的建立与初步应用

【作者】 陆亚冬； 刘贤侠； 陈创夫；

【机构】 石河子大学动物科技学院；

【摘要】 目的为了对牛冠状病毒抗体进行初步诊断,为规模化牛场犊牛冠状病毒的抗体的筛查提供一种便捷、高效、实用的诊断方法。方法根据Gen Bank登录的牛冠状病毒N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到p MD 19-T载体后进行测序,将测序正确的基因片段经Eco RI和Hind III双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,然后亚克隆入BL21(DE3)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。经亲和层析纯化好的牛冠状病毒重组N蛋白包被酶标板,进行间接ELISA实验,经各个环节的优化,确定好反应条件,初步建立了牛冠状病毒间接ELISA诊断方法,同时将原核表达牛冠状病毒核衣壳蛋白N,经亲和层析纯化后作为检测抗原,利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法,制备20nm粒径的胶体金颗粒,通过肉眼观察,可见金溶液为酒红色,透明均匀。优化金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus aureus protein A,SPA)为胶体金标记的最佳条件,制备牛冠状病毒免疫胶体金试纸条。结果成功克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1400bp,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE3相对分子质量为54KDa;重组蛋白BCV-32a-NDE3相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE3和BCV-28a-N-DE3和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。用建立好的间接ELISA的方法与进口的比利时瑞尔检测牛冠状病毒抗体的试剂盒同时对采集的新疆北疆部分地区:石河子、沙湾、奎屯、昌吉等10多个规模化牛场的腹泻犊牛血清26份和部分健康犊牛血清进行检测,符合率达到88.46%,同时将优化好的试纸条对临床采集的26份血清进行了检测,并与免疫印迹、ELISA作比较,验证牛冠状病毒免疫层析试纸条的可行性,结果是免疫层析试纸条检测线最佳N蛋白浓度为1.5mg/m L,质控线最佳划线浓度为10mg/m L,26份血清样本检测结果为牛冠状病毒免疫胶体金试纸条为38.4%(10/26)、WB34.6%(9/26)、ELISA46.1%(12/26),且试纸条与WB的符合率,高于WB与ELISA的符合率。结论获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好地免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。说明此方法适合用于规模化牛场致犊牛腹泻病原和血清抗体的初步检测,同时牛冠状病毒胶体金试纸条的诊断方法的建立,可用于规模化牛场对牛冠状病毒抗体的初步检测,也可为其他病毒检测试纸条提供借鉴。更多还原