BMSCs调控Mfn2/线粒体途径改善老龄化卵泡发育及质量的研究

【作者】 汪玲娟； 康莉娜； 相文佩；

【机构】 华中科技大学同济医学院计划生育研究所/生殖医学中心；

【摘要】 目的:证实BMSCs能调控Mfn2/线粒体途径改善老龄化卵泡的发育及质量。方法:选用第四代及以上的BMSCs分别与40周龄小鼠窦卵泡及颗粒细胞通过Transwell小室共培养,实验分为共培养组及单独培养组。利用CCK-8法分别检测两组颗粒细胞的活力,间接反映细胞的增殖能力以及ELISA法分别检测两组颗粒细胞培养上清中激素(E2、P)的分泌水平;采用磷脂结合蛋白V/PI细胞凋亡检测试剂盒及Western blot技术检测两组颗粒细胞凋亡情况和凋亡相关蛋白Caspase家族及Bcl2/Bax的表达情况;分别采用WB及qRT-PCR检测各组细胞Mfn2表达水平,检测线粒体膜电位及观察线粒体分布情况、ATP以及mtDNA水平评价线粒体功能。观察卵泡发育及成熟情况,免疫荧光观察卵母细胞MⅡ期纺锤体形态以及分析IVF后受精率情况。结果:BMSCs与颗粒细胞共培养后,共培养组颗粒细胞增殖能力增强,与单独培养组(0.164±0.012)相比,共培养组OD.值(0.298±0.054)明显升高且具统计学差异,共培养组雌二醇(pg/ml)与孕酮(ng/ml)浓度均呈上升趋势(*6.526±0.090 vs.5.823±0.158;*1.529±0.0434vs.1.000±0.0214,*P<0.05),流式及WB结果均显示共培养组细胞凋亡减弱,凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平显著上升以及Bax、Caspase9、Caspase3水平均下降(P<0.05);WB及qRT-PCR检测结果均显示,共培养组Mfn2水平与单独培养组比较均升高(P<0.05);JC-1结果显示,共培养组红绿荧光相对强度比值较大且流式细胞仪分析显示两组线粒体势能具有显著差异,说明共培养之后线粒体膜电位水平上升(P<0.05):单独培养组线粒体分布异常,其异常率(73.67%±4.54%)显著高于共培养组(56.54%±4.69%)(P<0.05);ATP(u mol/L)水平测定显示共培养组(4.11±0.09)相较单独培养组(3.0±0.15)显著上升;同样相较于单独培养组,共培养组mtDNA拷贝数明显升高(P<0.05)。BMSCs与老龄小鼠窦卵泡共培养后,未成熟卵母细胞成熟率在共培养组(74.4%)较单独培养组(57.0%)显著升高(P<0.05),老龄小鼠单独培养组卵母细胞纺锤体形态发生明显异常,单独培养组卵母细胞纺锤体异常率(49.73%±2.36%)显著高于共培养组(32.89%±2.15%)(P<0.05),IVF后共培养组受精率相较于单独培养组也显著提升(*77.9%vs.60.4%,*P<0.05)。结论:BMSCs可能通过上调Mfn2表达以及调节线粒体功能来改善老龄小鼠颗粒细胞的功能、促进其增殖并抑制其凋亡,进而改善老龄化小鼠卵母细胞的质量,对卵母细胞发育、成熟以及受精率产生影响。更多还原